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Edited by:
Rosalba Lanciotti, Universitagrave; degli Studi di Bologna, Italy
Reviewed by:
Monica Gatti, Universitagrave; degli Studi di Parma, Italy
Henrik Siegumfeldt, University of Copenhagen, Denmark
*Correspondence:
Hongfei Zhao zhaohf518@163.com
Bolin Zhang zhangbolin888@163.com
Specialty section:
This article was submitted to
Food Microbiology, a section of the journal Frontiers in Microbiology
Received: 03 January 2018
Accepted: 16 May 2018
Published: 04 June 2018
Citation: Yao C, Chou J, Wang T, Zhao H and Zhang B (2018) Pantothenic Acid, Vitamin C, and Biotin Play Important Roles in the Growth of Lactobacillus helveticus. Front. Microbiol. 9:1194. doi: 10.3389/fmicb.2018.01194
published: 04 June 2018 doi: 10.3389/fmicb.2018.01194
泛酸、维生素C和生物素在乳酸菌的生长中起重要作用
Chunxiao Yao1 , Jiandong Chou1 , Tao Wang1 , Hongfei Zhao1,2* and Bolin Zhang1,2*
北京林业大学生物科学与技术学院,2北京市林业食品加工与安全重点实验室,北京
乳酸菌是一种重要的乳酸菌。本研究中使用的菌株已证实了益生菌的功能,并具有生产功能性乳制品和生物活性肽的潜力。为探讨维生素对黑囊藻生长的影响,设计了化学确定的培养基,测定了9种维生素。泛酸(Vb5)、维生素C (Vc)和生物素是其生长所必需的。这三种维生素对菌株CICC 22171的葡萄糖代谢和能量代谢有重要影响。通过转录组学分析,我们发现三种维生素与脂肪酸的合成有关,参与细胞的能量供应。此外,Vb5参与细菌蛋白和脂类的代谢,并与各种酶的活性有关。结果表明Vc参与蛋白质代谢,生物素影响细菌胞内转运机制。在脱脂乳培养基中验证了维生素对菌株生长的促进作用。结果表明,Vc、生物素和vb5均能促进L.helveticus的增殖,但对保加利亚乳杆菌无显著影响
关键词:乳酸菌,维生素,荧光定量PCR,转录组,高密度培养
介绍
乳酸菌是食品工业中非常重要的微生物。LAB的主要特点是它们能将糖类物质发酵成乳酸(Jin, 1998),是需要碳、氮和生长因子才能生长的异养细菌。乳酸菌helveticus (L. helveticus)首次从干酪制品中分离得到,属实验室群。它被广泛应用于食品工业,特别是乳制品,如瑞士奶酪(Emmental, Comte)和意大利奶酪(Parmigiano Reggiano, Grana Padano和Provolone) (Vinderola et al., 2007)。黑氏乳杆菌作为一种有益健康的菌种,在益生菌和营养食品中发挥着重要的作用。当与益生元相关时,它也有潜力在发酵乳制品中产生生物活性肽或细菌素。因此,它可以被认为是食品工业的多功能乳酸菌(Giraffa, 2014)。由于L. helveticus具有高效的蛋白水解系统和生物活性肽生产能力,越来越多的研究关注于L. helveticus的增殖(Zhao et al., 2014)。脱脂乳培养基中添加乳糖可显著促进helveticus的生长,并观察碳源对菌株生长和代谢的影响(Zhao, 2014)。添加甜菜糖蜜和酵母提取物也提高了L. helveticus CNRZ 303的乳酸产量(Chiarini等,1992)。
Liao(2009)在培养基中添加18%的番茄汁,黑氏L. helveticus的活菌数达到3.59times;109。此外,培养基中添加麦汁也促进了L. helveticus的生长(Wu et al., 2008)。不仅如此,还有一些研究关注L. helveticus的高密度培养(Liang, 2015;刘,2016)。促进helveticus增殖的因子主要集中在碳源、氮源和生长因子上。大量的研究集中在碳源和氮源上,对维生素、氨基酸等生长因子的研究较少。在培养基中添加番茄汁或其他植物提取物促进了菌株的增殖,尽管这些添加剂是混合物,哪种化合物促进了菌株的增殖尚不清楚。维生素是重要的生长因子,需要添加到培养基中。它在菌株的生长中起着重要作用,但它们在微生物增殖中的作用尚不清楚。本研究的目的是:(i)测定黑草22171的维生素需要量;(二)探讨维生素对菌株CICC 22171增殖的作用机制;(三)是否可以将维生素的增殖推广到其他菌株的研究。
材料和方法
细菌种类和生长条件
由北京林业大学微生物实验室从新疆传统干酪中分离得到L.helveticus乳酸菌CICC 22171,保存在中国工业培养收藏中心。乳酸菌delbrueckii无性系种群。bulgaricus (L. bulgaricus) LB4由中金公司提供。helveticus CGMCC 1.1877从中国微生物培养总收藏中心(CGMCC)购买。菌株在37◦C的MRS培养基中培养18 h.
维生素L. helveticus CICC22171的需求量
为了研究维生素对菌株CICC 22171增殖的影响,设计了化学定义培养基(CDM)。具体情况见表1。培养基在121 ℃消毒15分钟,然后硫胺素(Vb1),核黄素(Vb2),泛酸(Vb5)、吡哆醛(Vb6)、叶酸(Vb9)、维生素C (Vc)、生物素、烟酸,4-aminobenzoic酸无菌过滤后被添加到清洁发展机制(0.22 -micro;m-pore-size过滤器)。对照检查(CK)组使用完整CDM。维生素缺乏培养基是指CDM中缺乏某种特定维生素的培养基。例如,缺乏Vc的CDM被命名为“Vc集团”。活细胞的数量通过MRS培养基中的菌落形成单位来测量。
维生素对菌株CICC 22171增殖的作用机制
维生素对葡萄糖代谢的影响
L.helveticus乳酸菌在MRS培养基中37◦C培养18 h。(4◦C, 6000 g, 5 min)离心收集细胞,用等体积无菌生理盐水洗涤2次。然后,收集沉淀,悬浮在等体积的无菌生理盐水中。使用一步法细菌活性蛋白提取试剂盒(上海生工生物技术有限公司,中国上海)从活化细胞中提取细菌蛋白。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法(Feng et al., 2010)。己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)在代谢通路中起重要作用,使用试剂盒(苏州科明生物科技有限公司,苏州,中国)测定这些酶的活性。
HK、PFK、PK、LDH基因表达采用RT-qPCR方法检测,实验设计参考MIQE指南(Bustin et al., 2009)。使用TRIzol试剂盒(上海生工生物技术有限公司,中国上海)提取总RNA,用无rnase的DNase处理。用AMV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物技术有限公司,上海,中国)反转录500 ng RNA样本。cDNA产品用于SYBR green为基础的RT-qPCR分析,每个样品运行三次。RT-qPCR条件如下:95◦C 3分钟,其次是95◦C 7s,57◦C 10 s,和72◦C 15s,最后一步72◦C 10分钟,循环40次。用CK组作为标准,16 s rRNA基因作为内部参考,和引物序列见表2。使用2minus;11Ctmethod计算DEGs的表达水平(Livak和Schmittgen, 2001)。.
维生素对基因表达的影响
转录组学分析用于测定在维生素缺乏培养基中的基因表达。将CK组与维生素缺乏组进行遗传差异分析。采用Trizol法提取总RNA。使用纳米光度计(Implen, Inc.,美国)检测RNA纯度。使用安捷伦生物分析仪2100系统的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性(安捷伦科技,美国)
TABLE 1 | Composition of chemically defined medium.
, Constituent Concn (g/liter) Constituent Concn (g/liter)
Glucose |
20.0 |
Riboflavin (Vb2) |
0.001 |
|
MgSO4 |
0.5 |
Vitamin b5 (Vb5) |
0.001 |
|
MnSO4 |
0.25 |
Pyridoxal (Vb6) |
0.002 |
|
K2HPO4 |
2.0 |
Folic acid (Vb9) |
0.001 |
|
Tween-80 |
1.0 |
Vitamin C (Vc) |
0.002 |
|
4-Aminobenzoic acid |
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