嗜铬杆菌胆固醇氧化酶DS1的表达优化、纯化及功能鉴定外文翻译资料

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嗜铬杆菌胆固醇氧化酶DS1的表达优化、纯化及功能鉴定

Aliakbar Fazaeli¹, Abolfazl Golestani², Mostafa Lakzaei², Samaneh Sadat Rasi Varaei²,Mahdi AminianID^2,3*

1 Departmentof Clinical Biochemistry, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil,Iran,

2 Department of Biochemistry, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Ardabil, Iran,

3 Recombinant Vaccine Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

摘要

胆固醇氧化酶是一种催化胆固醇氧化和异构化的双功能细菌黄素酶。这一有价值的酶因其在临床实验室、甾体类药物合成、食品工业等领域的广泛应用以及潜在的杀虫活性而备受关注。因此，开发一种高效的胆固醇氧化酶过量生产方案在这方面是有价值的和有益的。本研究考察了各种参数(宿主菌、培养基、诱导时间、异丙基-D-1-硫代半乳糖苷浓度、诱导后培养时间和温度)对铬杆菌属胆固醇氧化酶DS1表达的影响。在优化的工艺条件下，重组胆固醇氧化酶的产量从92 U/L显著提高到2115 U/L。在优化的条件下，大规模生产了该酶，并通过镍柱亲和层析从细胞裂解液中纯化了过表达的胆固醇氧化酶。用Lineweaver-Burk曲线图估算纯化后的胆固醇酶的Km值和Vmax。在此基础上，确定了该酶的最适pH和最适温度。这项研究报告了一种可以在任何实验室进行的简单的胆固醇氧化酶生产方案。

介绍

胆固醇氧化酶(EC 1.1.3.6)是氧化还原酶家族中的一种细菌黄素酶，催化胆固醇氧化异构化是胆固醇分解代谢的第一步。酶结构包括两个结构域：FAD结合域和底物结合域^[1]。根据FAD辅因子和辅酶之间的键的性质，该酶被分为两类：类型I，FAD辅因子与蛋白质非共价连接；类型II，辅因子与辅酶共价连接^[2]。这两种酶都作为有用的生物技术工具得到了广泛的应用。

胆固醇氧化酶(COX)主要用于临床实验室测定血清和其他生物样本中的胆固醇水平^[3]。此外，COX已经成为制药工业的有价值的药物，因为它具有生物转化3beta;-羟基类固醇的能力^[4]。同时，COX已经做了许多尝试来降低食物中的胆固醇含量^[5-7]。此外，许多报告都提到了COX在害虫控制策略中的作用^[8，9]。

产生胆固醇氧化酶的细菌分为两类：非致病细菌和致病细菌。非致病细菌利用COX作为代谢工具从胆固醇分解中获得碳源，而致病细菌则倾向于利用这种酶通过氧化膜胆固醇来感染宿主巨噬细胞^[10]。由于胆固醇氧化酶在各个领域的广泛应用，在表达宿主中生产重组形式的胆固醇氧化酶已经做了很多努力。到目前为止，许多来自不同细菌来源的COX基因已经被克隆和表达^[11-26]。

嗜铬杆菌胆固醇氧化酶DS1(CHO)的研究被纯化，并由Doukyu等人进行了鉴定^[27]。纯化的酶分子量为58 kDa，通过消耗2摩尔的O₂将胆固醇氧化为羟基过氧胆甾烯-3-酮(HCEO)。此外，据报道，与商业上可用的胆固醇氧化酶相比，该酶在高温和在洗涤剂和有机溶剂存在的情况下非常稳定^[27]。这些特性使CHO成为一种适合工业和临床实验室使用的酶。

重组CHO的大量生产为其生化特性及其在工业和临床过程中的应用提供了便利。为此，在本研究中，我们设计了一种简单而有效的方法，通过优化摇瓶培养条件来最大限度地提高CHO产量。

材料和方法

菌株、材料和培养基

大肠杆菌宿主菌株BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta-Gami2(DE3)从美国威斯康星州麦迪逊的Novagen公司获得。质粒pET24b-CHO的合成订购给Bio Basic Inc.(加拿大安大略省)。Ni-CAM HC树脂、异丙基-beta;-D-硫代半乳糖苷、卡那霉素和氯霉素购自Sigma-Aldrich(美国墨尔本)。所有其他化学品均由默克化学公司(德国达姆施塔特)制备。液体培养基：Luria-Bertani(LB，10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L NaCl，默克公司)，超级肉汤(SB，32g/L蛋白胨，20g/L酵母膏和5g/L NaCl，默克公司)，特级肉汤(TB，12g/L蛋白胨，24g/L酵母膏，8g/L甘油，17 mM KH₂PO₄和72 mM K₂HPO₄，默克公司)。

重组CHO表达的优化

CHO在不同宿主大肠杆菌中的表达。首先，研究了三种不同的大肠杆菌菌株产生我们所需的酶的能力。为此，将铬杆菌属胆固醇氧化酶DS1基因(GenBank登录号AB456533.1)设计在NdeI-BamHI酶切位点(GenBank登录号MH892608)之间的pET24b( )质粒中，化学转化BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosettagami2(DE3)。转化细胞接种于含50mu;g/mu;L卡那霉素和25mu;g/mu;L氯霉素的LB琼脂中，用于BL21(DE3)pLysS和Rosetta-Gami2(DE3)。过夜培养后，每株菌的单个菌落在3mL含上述抗生素的LB培养基中过夜，在37˚C的旋转摇床(160rpm)上培养。次日，将10mL LB抗生素培养基加入100mu;L的预培养基中，在相同条件下培养。一旦细胞进入指数期中期(OD600nm0.6)，加入0.5mMIPTG诱导蛋白表达，37˚C孵育6h，然后在7000xg、4˚C、10min下离心收集细胞，然后将细胞悬浮在0.5mL pH7.0的PBS缓冲液中，然后将细胞悬液放入pH7.0的0.5mL磷酸盐缓冲液中孵育6h，然后以7000xg、4˚C和10min的离心法收集细胞，再将细胞悬浮在pH7.0的0.5mL PBS缓冲液中。用频率为20 kHz、振幅为75%、占空比为0.7s的超声破碎悬浮细胞10min，裂解液以13000times;g、4˚C离心20min，采用Allain等人的关于粗提物^[27，28]方法进行酶活性测定。测定混合物为100 mM磷酸钾(pH 7.0)、1 mM胆固醇、21 mM苯酚、1.4 mM 4-氨基安替比林和5U/mL过氧化物酶。反应开始时，将10 0mu;L样品加入1mL测定混合物中，在5 0 0 nm处连续监测红色发色团的出现，实验结果以三次实验的平均值plusmn;SD表示。不含酶或不含胆固醇的空白通常是平行进行的。一个活性单位被定义为在25mu;C下每分钟形成1mu;摩尔的过氧化氢(0.5˚摩尔的奎尼亚胺染料)。

优化培养基。为了确定不同培养基对活性CHO产量的影响，对三种培养基(LB、TB和SB)进行了评价。筛选出含有pET24-CHO质粒的Rosetta-Gami2(DE3)菌株，在3mL LB培养基中过夜培养。然后，将预培养的细菌按1：100的比例接种到10mL培养基中。当OD₆₀₀达到0.6时，用0.5mM的IPTG诱导培养，在37˚C，160rpm下培养6h，收获培养物，将颗粒重新悬浮在0.5mL的PBS缓冲液中。超声处理后，细胞裂解液在13000times;g、4˚C、20min的条件下离心。在粗提液中进行酶活性测定，测定重组酶的总活力，进行产量测定。

最佳诱导时间。用100mu;L过夜培养的Rosetta-Gami2(DE3)-pET24-CHO接种于4个装有10mL TB培养基的摇瓶中，37˚C，160rpm培养。当OD₆₀₀达到0.3、0.6、1.2和1.8时，用0.5 mM IPTG进行诱导。诱导培养条件为37˚C，160rpm孵育6h。细胞破碎、离心后，用酶活力测定法定量测定酶活性。

最佳诱导剂浓度。含pET24-CHO的Rosetta-Gami2(DE3)细胞在LB抗生素培养基中过夜培养。将含有10mL TB培养基的新鲜培养物(5个三角瓶)接种(1：100)，在37˚C，160rpm下培养。当OD₆₀₀达到0.6时，分别用0.05、0.1、0.25、0.5和1 mM的IPTG浓度进行诱导。37˚C，160rpm孵育6h后，收集细胞，超声破碎，测定酶活性。

诱导温度和诱导后孵化时间。考察了不同培养温度(25˚C、30˚C和37˚C)以及诱导后培养时间(6、8、16和24 h)对CHO产量的影响。为此，将含有CHO基因的预培养Rosettagami2(DE3)0.2mL接种到3个装有20mL TB培养基的摇瓶中，OD₆₀₀达到 0.6是用IPTG进行诱导，IPTG最终浓度为0.1 mM。诱导结束后，分别在160rpm、25˚C、30˚C、37˚C下摇瓶，以不同的时间间隔(6、8、16、24 h)提取2mL培养液，确定适宜的诱导后培养时间。收集的样品离心后，将颗粒重新悬浮在缓冲液中，然后用超声波破碎细胞。酶活性测定用于对制备的粗提物中表达的重组酶进行定量。

重组CHO的规模化生产

在优化条件下进行了CHO的规模化生产。预培养采用5mL LB[卡那霉素(50mu;g/mL)和氯霉素(25mu;g/mL)] 50mu;L罗塞塔-伽马2(DE3)-pET24-CHO甘油原液。然后，将500mL结核/抗生素接种于5mL预培养培养基中。当OD₆₀₀达到0.6时，加入0.1 mM的IPTG，在30˚C、160rpm的条件下诱导CHO基因表达16h，收获的菌球再悬浮在10mL的再悬浮缓冲液(PBS，Nacl 0.3M，咪唑5 mM，pH 7)中，超声破碎。细胞裂解液在13000times;g，4˚C下离心20min，上清液用于亲和层析纯化CHO。

重组CHO的纯化

用镍螯合亲和层析(Ni-CAM HC Resin-Sigma)纯化重组CHO。为此，最初将柱(2mL)与30mL平衡缓冲液(PBS，NaCl 0.3M，咪唑5 mm；pH 7.0)以1mL/min的速度平衡。然后，将含有210 mg蛋白质的酶粗提物10mL加载到色谱柱上，用平衡缓冲液洗脱，直到280 nm处的吸光度达到基础水平。蛋白洗脱用缓冲液(PBS，NaCl 0.3M，咪唑150 mM，pH 7.0)，并对释放的蛋白进行分级。用10%的SDS-PAGE分析分级样品的纯度。将纯化的CHO组分混合在一起，在4˚C、pH7.0的50 mM磷酸钠缓冲液中透析16h，用Bradford^[29]法测定重组CHO的蛋白浓度，用酶法测定其酶活性，以确定重组CHO的纯度和比活力。

纯化CHO的动力学特性

在不同温度(30˚C~80˚C)下测定重组CHO活性，以确定重组酶的最适热活性。在不同pH(3~11)条件下，通过25˚C的酶活力测定，确定了重组酶的最适pH。缓冲体系是根据Doukyu等人制备的^[27]。根据从含有0-1 mm胆固醇底物的分析溶液获得的数据的Lineweaver-Burk曲线图，估算胆固醇的Km和Vmax值。

结果

重组CHO表达条件的优化

CHO表达的最佳宿主菌株。用摇瓶培养法检测了BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta-Gami2(DE3)产生重组CHO的能力。相应地，当OD₆₀₀达到0.6时，用0.5mM IPTG进行诱导，并在37˚C、160rpm条件下持续表达6h。超声波作用后，细胞裂解产物离心，上清液回收为粗裂解产物，以测定每升培养基产酶活力单位。Rosetta-Gami2(DE3)细胞产生活性最高的重组CHO活性为218U/L(图1)。此外，从BL21(DE3)pLysS获得的总活性酶量比从BL21(DE3)获得的值要高。

Fig 1. Cholesterol oxidase expression in various host strains. The influence of host strain on the recombinant enzyme yield and bacterial biomass accumulation was evaluated under 6-h cultivation at 37˚C.

CHO表达的最佳培养基。对三种不同的培养基(LB、TB和SB)对Rosettagami2(DE3)细胞生产可溶性CHO的效果进行

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