酸樱桃的遗传转化Cerasus vulgaris Mill（欧洲酸樱桃）S. V. DOLGOV外文翻译资料

 2021-12-15 09:12

英语原文共 10 页

酸樱桃的遗传转化Cerasus vulgaris Mill（欧洲酸樱桃）S. V. DOLGOV

  1. 介绍（Introduction）

酸樱桃（Cerasus vulgaris Mill。），一种四倍体物种（2n = 32），是一种甜樱桃（c.avium L.）和地面樱桃（c.fruticosa）（Pall）的天然杂交种。由于这种樱桃早熟，它的果实被认为是特别有价值优质的新鲜水果，具有滋补作用。它的食物价值是因为其相当高含量的糖（6.5-15.5 ％），有机物酸（0.7-3.0 ％）和大量的生物活性化合物。酸樱桃还含有丰富的维生素C（15-30 mg％）和维生素P复合物。酸樱桃含有1-2毫克％的铁（超过苹果）以及含有有效浓度的维生素B9（叶酸）和维生素B2（核黄素）。这种物质复合物可预防贫血。

酸樱桃可以作为新鲜水果和干果食用。 新鲜樱桃可以冷冻保存6至9个月，也可以加工成炖水果，果酱以及果汁等产品来保存使用。

Cerasus vulgaris是亲本物种C. avium和C. fruticosa之间的中间体，具有二者必需的生物学特征的表型特征。尽管其存在种内变异性，但没有品种能够有利地结合了地面樱桃的高抗冻性和鸟樱桃的甜味两种有价值特性。植物育种者在一个品种中同时获得高抗冻性和良好口感质量的尝试的不成功可能表明这些特征或许具有逆向依赖性（即所谓的偶联遗传），即甜味新鲜果实品种不具有抗霜性，或者抗霜冻的新鲜果实品种有酸味。

所以在这方面上，通过基因工程的方法，想要实现的酸樱桃品种选择的主要目标是：（1）增加樱桃抗寒性，例如开花芽时期对春霜的抵抗力。即使这种抗性能增加2-3℃，也可极大地促进在可种植的北部地区获得相对稳定的樱桃作物的规律性，而这可种植的北方地区这与俄罗斯工业发达的地区相吻合。由于樱桃的贮藏能力差，能否增加樱桃抗寒性这个问题非常重要;（2）改善抗冻栽培品种的口感品质，例如，通过超甜蛋白，奇异果甜蛋白和色氨酸的基因转移可以实现目标品种的口感改善;（3）通过绿色嫁接改善樱桃品种的营养繁殖。具有高价值的品种通常具有较低的生根能力，但这可以通过转基因发根农杆菌基因来改善。

与其他农作物的情况一样，增加樱桃品种对植物病原体的抗性也是重要的。首先，由感染剂如Coccomyces hiemalis Higg.，Clasterosporium car-pophilium Aderch和Monilia cinerea Bon引起的真菌疾病。

尽管有许多论文致力于开发具有基于石材培养的遗传转化技术，如桃（Smigovcki和Hammerschlag， 1991年），李子（Scorza等人，1994,1995年）和杏（Machado等人，1992年）， 从体细胞组织中完成有效植物再生的问题仍在等待着解决方案。在大多数情况下，仅仅使用种子或部分幼苗来完成植物再生，但它们的高杂合性限制了它们用于改良农艺学重要栽培品种的用途。最近详细阐述的通过悬浮培养进行李子再生和转化的高效技术（Machado等人，1995年）无疑是石果培养转化领域的重要贡献，尽管在这项研究工作中，实验使用了多种研究混合形式。

使用Colt甜樱桃砧木的原始培养物（C avium x P seudoceras~ts）（Ochatt 1993年; Ochatt和Power 1988年; Ochatt等人，1987年）和CAB系列的杂种克隆获得了樱桃再生研究的积极结果。 （Ochatt ，1990）。在两种形式的研究结果中均观察到来自原生质体衍生的愈伤组织的根和芽的形成。最近报道了从叶组织成功再生甜樱桃209/1砧木（C vulgaris var.Schattenmorelle x C canescens）的有趣数据（Yang等人，1991年）。值得注意的是，在所有的这些情况下，包括李子树再生研究在内，都采用了具有低质量但具有高植物繁殖能力的新鲜水果的杂交砧木形式。

关于Cerasus物种遗传转化的数据更加稀缺。通过使用偶联的rol A，B，C基因进行Colt转化以研究获得酸甜樱桃矮化砧木的可能性研究（Gutier-rez-Pesce等人，1997年），这是作者已知的。

  1. 材料和方法（Materials and Methods）

植物材料。 将来源于第四米丘林中央遗传实验室（Michurinsk）（the I.v. Michurin Central Genetical Laboratory）中的六种商业品种的酸樱桃品种和Cerasus fruticosa x Cerasus avium（变种黑鹰） 用于我们的实验研究。在QL培养基（Quorin和Lepoivre， 1977年）（含有1 mg / ml的BAP和0.3 mg / l的lEA）上体外培养植物，并且在用（0.5-1 mg） lEA补充的半强度QL培养基上进行植物生根。酸樱桃的繁殖和生根在以下条件下进行：温度26/22 ℃; 日长16小时; 照度2500-30001x。

再生。 从3-4周龄的根系体外植物切下面积约1 cm2的叶片。 再将再生培养基倒置并且在22-25℃的黑暗环境中培养，每3周将其转移至新鲜培养基。再生培养基由MS（Murashige和Skoog ，1962年）盐与生长调节剂和酪蛋白水解物组成。 在培养10周后，观察一个外植体的再生频率和不定芽数。

农杆菌菌株、质粒。 为了转化酸樱桃基因，实验使用了冬季比目鱼克隆IIA7的抗冻蛋白（AFP）基因（Lin和Gross 1981年; Gourlie等人，1984年）。将对应于前原肽的AFP基因序列克隆到pPCV635中（由N. Strizhov博士，MPI fUr Zuchtungsforschung，Cologne，Germany提供）。在该质粒中，AFP基因序列处于35S启动子CaMV的控制下，并且侧接于A.tumefadens的nos基因的3#39;末端终止子序列。pPCV635含有潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因作为nos启动子控制下的植物选择标记。 质粒pPCV635还含有基因NPTII的无启动子序列。将载体pPCV635转移至A.tumefadens菌株GV3101（pMP90RK的质粒辅助细胞）。具有HPT选择标记的载体35GUSint用于CBE21中的解除了破坏性的超毒力农杆菌菌株EHA105和pBI121（Revenkova等人，1993年）。在转化之前，在摇床上将细菌在含有100 mg / ml羧苄青霉素和50 mg / ml利福平的LB培养基上培养过夜至A600，等于0.6-0.9，然后用不含抗生素的液体MS培养基洗涤两次。

转型。 转化体的选择和再生。 使用来自酸樱桃的带根植物的约1cm 2的叶片进行转化。用含有无激素的MS培养基在温度26℃的条件下培养具有农杆菌的叶外植体。共培养后，将外植体置于培养基上进行再生，并选择含有2mg / l BAP的转化体（MS）。 1 mg / l NAA，1 mg / l IAA和500 mg / l头孢噻肟。在第二次传代开始时，向生长培养基中加入25 mg / l卡那霉素（载体pBI121GUS）或5-10 mg / lggromycin（载体35GUSint，pPCV635）。 在黑暗环境中已经温度26℃条件下进行再生。

将生长至5-7 mm大小的再生物与愈伤组织分离，并且用50 mg / ml卡那霉素或10-15 mg / l潮霉素置于繁殖培养基（参见上文植物材料（Plant MateriaL）的板块）上。用选择性抗生素在培养基上连续繁殖转化体。在这些培养条件下培养酸甜樱桃杂种的转基因植物。

生化测试。 在来自酸 - 甜樱桃杂种的愈伤组织细胞的细胞提取物中测定NPTII活性（Staebell等人，1990年）。另外，基因GUS的表达通过荧光测定和组织化学确定在由载体pBI121GUS和35GUSint转化的细胞系中（Scott等人，1988年）。

分离基因组DNA以及 PCR分析。 将从温室植物收集的100 mg新鲜叶子在液氮中研磨粉碎。 通过Gelvin和Schilperoot（1994年）的方法从提取的材料中分离基因组DNA。

PCR分析用于证实基因HPT和AFP序列在转基因植物基因组中的整合。扩增反应在含有7 mM Tris-HCl（pH8.8），15 mM N2SO4#39;6mMMgCh，0.2 mM各dNTP，0.2 mg / ml BSA，0.5％Nonidet NP40,2单位Taq聚合酶，11 mu;gDNA的缓冲液中进行。 将体积为30 mu;l的每种引物的25 pkM。将四十三种矿物油层叠到反应混合物上。扩增条件如下：初步变性（100plusmn;0℃）2分钟; 退火引物（58℃用于HPT，65℃用于AFP）1分钟;精制链构建（72℃）1.5分钟; 变性（94.5℃）1分钟; 扩增周期数30周。用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。扩增片段的长度为AFP基因212bp，HPT 680bp。

  1. 结果（Results）

再生。 当叶盘用作外植体时，仅在测试的六个栽培品种中的两个中获得再生剂。在B6和IAA浓度分别为2-3和0.2-1 mg / I的培养基N6和QL上，Komsomolskaya品种和VIadimirskaya品种外植体分别以5-10和12.5-20％的频率观察到了不定芽的形成。

当使用 2-iP作为细胞分裂素和具有玉米素的培养基时，主要在Komsomolskaya品种中，叶外植体上形成了更多的根。低浓度的玉米素（O.05-0.5 mg / l）和2iP（0.5-1 mg / l）可以导致正常根的形成，所以我们设法将其转移到Smimov培养基上（mod. White，1963年）。

在补充有BAP（1-3 mg / I）和IAA（0.2-0.3 mg / l）的培养基上，主要在外植体切割表面上观察到了愈伤组织的形成。通过Ochatt-BAP（2-3 mg / l），NAA（0.01-0.05 mg / l）和玉米素（0.05-0.5 mg/l），将由此获得的愈伤组织进一步转移至富含植物激素的N6（Chu等，1975年）矿物盐培养基中 ,以此导致Komso-molskaya品种在此培养基中以20-35％的频率形成芽。在含有BAP（3mg / l）和IAA（0.3mg/l）的培养基上获得的愈伤组织中含有BAP（3 mg / l），NAA（0.03 mg / l）和玉米素（O.2 mg / l）的培养基达到最大估计值。 Ochatt（1993年）报道了类似的研究结果。

对于通过交叉C. fruticosa x C avium（var.Black Eagle）获得的酸 - 甜樱桃杂种，显示出了最高的再生能力（表1）。根据我们的数据，叶盘成功的樱桃再生（Yang等人，1991年）仅对杂交20911植物（c.avium val.Schattenmorelle x C. canescens）进行。

在具有相同含量（2 mg / l）的细胞分裂素和生长素的培养基上，发现最有效的再生。在仅含有一种生长素的培养基上，分别添加NAA和IAA的再生剂（25％和44％）较少，同时两种激素（每种1 mg / l）的再生百分比最高，为60％。

表1。 酸樱桃叶盘的再生

转型。 许多农杆菌菌株在体外接种酸樱桃茎段显示出与苹果，草莓和葡萄相比，这种培养物具有高毒力，仅次于梨（表2）。使用大量的二元和硬币 - 载体系统在体外转化这些茎段，使我们能够在具有高潮霉素和卡那霉素含量的培养基上以高频率的方式获得以成功增殖的一系列愈伤组织系。在pGV3850转化的植物的愈伤组织中，可以很容易的检测到胭脂碱合成和高NPTII活性（图1）。

表2。 不同农杆菌菌株对水果和浆果作物的毒力

图1 。 酸性樱桃转基因愈伤组织的NPTII测定。 1：控制工厂; 2：转基因烟草; 3-8：转基因酸樱桃愈伤组织系

由于商业品种的再生能力较低，将酸甜樱桃杂交种的植物品种用于遗传转化的进一步实验研究。基于NPTII选择性标记的整合和二元载体系统的转化导致形成具有易于检测的新霉素磷酸转移酶（pGV3850）或beta;-葡糖醛酸酶（CB E21：p B 1121）活性的愈伤组织（图2）。 在软选择（25 mg / ml卡那霉素）时，偶尔形成单独的褪绿芽，其在进一步转移到补充有浓度为50 mg / l的卡那霉素的培养基时死亡。在所有转化实验中，我们未能获得其中NPTII用作选择标记的转基因植物。 在进一步的工作中，使用具有编码潮霉素磷酸转移酶（HPT）的选择性基因的载体系统。

图2 。在CBE 21中由pBI121转化的酸樱桃愈伤组织中的GUS表达

选择的最重要问题之一是使栽培品种对不同的非生物胁迫具有抗性，其中之一是对早春霜冻的耐受性。早春霜冻会破坏花和卵巢，导致产量损失和影响其后期结果。从北极鱼（AFP）转移抗冻蛋白基因是提高抗冻性的一种方法。在我们的实验研究中，我们使用了来自冬季比目鱼（Pseudopleuronectes americanus）的AFP基因。

来自冬季比目鱼的编码蛋白的抗冻蛋白基因，具有91个氨基酸，由前原肽和成熟蛋白（53个氨基酸）组成（Gourlie等人，1984年）。已经对该基因产物的作用机理进行了足够详细的研究（Davies和Hew，1990年），其目的是在于通过将AFP与生长的冰晶体结合来延迟组织内冰晶的生长 （1990年）。用冬季比目鱼的AFP基因获得了烟草转基因植物。转基因植物的特征在于在降低了3-5℃下冷冻温度下的抗性，这证实冬季比目鱼的AFP基因可能增加植物对霜的抵抗力。

为了转移编码冬季比目鱼的抗冻蛋白（AFP）

资料编号：[5189]

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