建立了大豆皂苷的HPLC/ELSD分析方法外文翻译资料

 2021-12-15 09:12

英语原文共 8 页

建立了大豆皂苷的HPLC/ELSD分析方法

J. LIN和C. WANG

摘要:建立了一种高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC/ELSD)方法，测定大豆中大豆皂苷B的天然形态(g, g, A, g, A)和不(V, I, II, III, IV) 2,3-二氢-2,5-二羟基-6-甲基- 4h -吡喃-4- 1 (DDMP)。日测定的变异系数lt; 9.51%，日测定的变异系数lt; 10.91%。将大豆皂苷I作为所有大豆皂苷定量的外部标准，确定其在特定操作条件下的ELSD信号响应基本相同。对大豆皂苷Bs的提取条件进行了优化，建立了大豆皂苷Bs在自然状态下的提取贮存条件。大豆皂苷g的活化能为40.76 kJ/mol。大豆皂苷I和II的回收率分别为98.3%和93.1%。5份大豆样品的总大豆皂苷平均含量为3.37 mol/g，范围为2.78 ~ 4.03 mol/g。该方法简单易行，比现有方法制备样品所需时间短。

关键词:HPLC , ELSD，分析，皂苷，大豆。

介绍

皂苷是存在于蔬菜和豆类中的天然表面活性剂，如菠菜、西红柿、土豆、燕麦和大豆。化学上，皂苷是甾醇或三萜苷。大豆皂苷是膳食皂苷的重要来源之一。大豆中发现了三组大豆皂苷:A组、B组和E组(Shiraiwa等1991a、1991b;和其他1993年，1995年)。大豆皂苷B的结构如图1所示。皂苷的潜在健康益处包括降低胆固醇的活性(Hendrich和其他2000;《癌症化学预防》(全与宋，2000;Oh和Sung(2001)、HIV(人类免疫缺陷病毒)感染抑制(Hayashi和其他人1997)、免疫调节和抗氧化特性(Sung和Park 2000)。全豆制品中大豆皂苷的含量各不相同。整个大豆中含有4.04 mol/g皂苷(胡等，2002)，脱脂豆粕中含有11.55 mol/g皂苷(Gu等，2002)。采用薄层色谱法(TLC)、密度法(Gurfinkel and Rao 2002)、衍生化后的气相色谱法(Kitagawa等1984)、紫外(UV)检测的高效液相色谱法(HPLC)和柱前或柱后衍生化法(Oleszek等1999)对皂苷进行了定量估计;noack and Oleszek 1994)，质谱/核磁共振(MS/NMR) (Bialy等1999)，液相色谱(LC)/MS/MS (Wang等1999);崔和其他人2000)，LC/ MS(顾和其他人2002)，以及可见光/近红外探测(任和陈1999)。Kudou等(1994)发现B和E皂苷中含有2,3-二氢- 2,5 -二羟基-6-甲基- 4h -吡喃4-酮(DDMP)部分，通过醚键连接到大豆皂苷B和E的C-22羟基上采用高效液相色谱法测定DDMP皂苷比不加DDMP的皂苷更容易提取。这是由于DDMP皂苷在292nm处具有吸光度(胡和其他2002年)。近年来，采用蒸发光散射检测器(ELSD)对人参皂苷进行了分析。ELSD检测不需要衍生化(Ganzear等，2001;李和菲茨洛夫2001)。然而，到目前为止，HPLC/ELSD还没有被用于大豆皂苷的测定。本研究的主要目的是建立HPLC/ELSD法测定大豆中天然大豆皂苷(大豆皂苷B和ddmp -偶联大豆皂苷B)的含量。

材料和方法

大豆样品制备

混合品种的大豆从2000年作物年(来自南达科塔)被集中起来的方法发展。采用该方法对另一项研究中采集的五种不同的大豆样品进行了大豆皂苷浓度分析。所有大豆样品均用ZM-1型瑞奇超离心磨碎机(Brinkmann Instruments Co.， Haan, Germany)研磨。所有样品均采用0.5 mm筛分。

Soyasaponins标准准备

采用改进的半制备高效液相色谱法(胡等，2002)制备了ddmp -共轭大豆皂苷B标准品g、g、a，以及大豆皂苷B标准品v、I、ii，如图2所示。高效液相色谱系统由2个水510个高效液相色谱泵(米尔福德，马萨诸塞州)组成。和Rheodyne 7725i手动注射器(Rheodyne, Cotati, Calif . usa)。系统由Waters Millennium 3.2软件控制。制备柱为Alltech Econosil C18, 10 (10 m, 250times;22 mm内径)(Alltech, Deerfield, Ill。,美国)。以0.05%三氟乙酸(A)和100%乙腈(B)为流动相，采用高效液相色谱法测定流动相。流速为5.0 mL/min。注射量为5.0 mL，制备DDMP大豆皂苷B标准品时，将溶液A在60 min后由54%降至48%，紫外吸收度设为292 nm。在不添加DDMP的条件下制备大豆皂苷B，将溶液A在60min内从60%降低到52%，紫外吸收度设为205 nm。采用Waters 486可调吸光度检测器(Waters)进行紫外检测。甲醇、乙腈、三氟乙酸和高效液相色谱级水均购自Fisher Scientific (Fair Lawn, N.J.),美国)。

采用Finnigan MAT LC-MS系统，由光谱系统P4000泵、光谱系统AS 3000自动采样器和Thermo Quest Navigator MS组成。LC/MS系统由Xcalibur软件控制(Finnigan, San Jose, Calif.， usa)。正离子采用质谱仪，扫描范围保持在m/z 400 ~ 1500之间。ESI针尖上的毛细管电压为4.0 kV，源电压为50v，探头温度为200℃。

HPLC/ELSD分析

本研究采用水相高效液相色谱法。它由2个Waters 510高效液相色谱泵(Waters)、一个Spark Holland马拉松自动取样器(Spark Holland, Emmen, Netherlands)和一个Alltech 2000 ELSD检测器组成。系统由一台装有Waters Millennium 3.2软件(Waters)的PC机控制。采用YMC-pack ODS-AQ S-5柱(5 m, 120 A, 250times;4.6 mm内径)和AQ S5保护柱(Waters)。提取液通过0.45 m注射器过滤器过滤。采用改进的梯度程序(胡等，2002)，以0.05%的三氟乙酸(A)和100%的乙腈(B)为多级梯度，实现了最佳的分离效果程序。表1显示了渐变程序。柱温为室温(20℃)。流速为1.5 mL/m，注入量为100.0 L。ELSD检测器蒸发温度设定为120℃，其中超纯氮气(Praxair Inc.， Danbury, Conn.， U.S.A.)为2.0 L/m雾化气体。增益设置为1，而impactor是关闭的。

大豆皂苷的ELSD信号响应研究

通过实验测定了大豆皂苷的信号响应。表2显示了研究中使用的6种不同大豆皂苷的浓度。所有皂素标准品均以80%甲醇为原料制备。比较了大豆皂苷的斜率和截距，以确定它们是否具有类似的ESLD信号响应。

量化和峰值验证

基于上一节的结论，利用大豆皂苷I纯化标准品对所有其他形式的大豆皂苷B进行定量，因为它们与ELSD具有相同的响应因子。采用光谱系统P4000泵组成的Finnigan MAT LC-MS、光谱系统为3000自动采样器和Thermo Quest Navigator MS对含有和不含DDMP的大豆皂苷B进行了形态鉴定。采用Xcalibur软件对LC/MS系统进行控制。

Soyasaponins提取研究

通过以下提取研究，优化了提取时间和提取液体积。为优化提取时间，在40 mL 80%甲醇中加入5 g大豆粉。搅拌0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h，通过Whatman nr 42滤纸(英国肯特郡Whatman International Ltd.)将溶液过滤到500 ml的量瓶中。残渣用80%甲醇洗涤两次，每次10毫升。用同样的方法将滤液稀释到一定的体积。样品分三次制备。为优化提取液体积，分别在20、30、40、50 mL 80%甲醇中加入大豆粉5 g。这种混合物搅拌了30米。通过Whatman nr 42滤纸将溶液过滤到50ml容量的烧瓶中。用80%甲醇进行两次洗涤。用同样的方法将滤液稀释到一定的体积。样品分三次制备。采用HPLC/ELSD法测定皂苷的含量，并利用峰面积确定最佳提取条件。所有提取均在室温(20℃)下进行。

DDMP皂苷热稳定性的测定

将5克磨碎的大豆加入40.0 mL 80%甲醇中。这种混合物搅拌了30米。通过Whatman nr 42滤纸将溶液过滤到500 ml的容量瓶中。用10毫升80%甲醇冲洗两次。用同样的方法把滤液稀释到一定的体积。样品分别保存于4℃、20℃、30℃。在0、2、4、8、10、14、16 h和1、2、3 d时，将重复的aliquots去除，保存30°C;在0、1、3、5、7、9、11、13、15、17 h、1、2、3 d温度下存放20℃;在0 6 12 18 h，在12 3 5 d为4°C储存。采用HPLC/ELSD法测定皂苷的含量，并将其与贮藏时间进行比较。

分析方法的重现性和回收率

为了验证该方法的准确性，在24小时内对6份大豆样品进行了重复分析，以评价日变化。在一个月的时间里，对样本进行6天的独立分析，以评估分析的日间变化。为了研究该方法的准确性，我们使用了有尖刺的样品。每个样品加入大豆皂苷I标准(0.520 mol)和大豆皂苷II标准(0.250 mol)。计算了添加大豆皂苷I和II的回收率。

统计分析

计算均值、标准差和方差系数的准确性和精密度。采用线性回归得到大豆皂苷b的标准曲线。提取数据、热稳定性数据、回收率研究数据采用SAS系统第8版(SAS Inst. Inc. 1999)进行方差分析和t检验进行统计分析。

结果与讨论

标准的准备

从大豆中分离到DDMP (g, g, a)和非DDMP大豆皂苷B (I, II, V)。添加和不添加DDMP的大豆皂苷B的色谱图如图3和图4所示。采用反相高效液相色谱法对分离得到的大豆皂苷B进行了鉴定，并用LC/MS对其进行了确证。用高效液相色谱法测定，这些标准品的纯度均高于88%。这些值与文献报道的值一致(胡和其他2002年)。使用上述程序成功地制定了标准。然而，制备大量单独纯化的标准品是昂贵的。

大豆皂苷B的ELSD信号响应

由于DDMP大豆皂苷B标准的成本和不稳定性，我们最希望使用一个稳定的标准来量化所有不同的大豆皂苷B形式。考虑到ELSD的检测机制，我们假设这对于所有的皂苷都是正确的，因为它们具有相似的理化性质。为了验证这一假设，我们进行了一个实验来确定大豆皂苷的信号响应。研究了6种大豆皂苷B标准品的ELSD信号响应。用对数变换峰面积与对数变换浓度的关系建立了三种化合物的标准曲线。坡度和截距采用线性回归计算，如表3所示。结果表明，6种皂苷的斜率在1.183 ~ 1.231之间，截留量在1.883 ~ 1.986之间。6种皂苷在斜率和截距上均无显著性差异(P gt; 0.05)。这是一个非常重要的发现，因为结果表明，任何1 / 6的皂苷可以用来量化所有其他皂苷。从成本、制备简便、稳定性等方面考虑，大豆皂苷I是最佳的定量标准。这与其他使用ELSD的研究人员的结果一致。Fang等(2001)发现具有相似化学结构的com磅和分子量在300 - 700或更大的com磅在ESLD中具有相同的响应。然而，分子量小于或等于300的化合物在ELSD中表现出明显的不同反应。

萃取条件优化

图5为提取时间对大豆皂苷g峰面积的影响。可以清楚地看出，0.5 h和1h提取的浓度最高。由于大豆皂苷g具有明显的不稳定性，所以提取时间越长(2和3小时)，其浓度越低。0.5 h和1 h提取液的浓度无统计学差异。因此，本研究的剩余时间选择0.5 h作为提取时间。Daveby等(1998)也研究了提取时间对天然大豆皂苷B的测定。他们还发现ddmp结合的大豆皂苷I在室温下经过0.5 h的萃取后分解为大豆皂苷I。研究了萃取溶剂体积对萃取效率的影响。图6为不同提取液(80%甲醇)体积下大豆皂苷g的浓度。结果表明，40.0 mL和50.0 mL提取液的浓度最高，但两者之间无统计学差异。因此，选择80%甲醇40.0 mL，提取时间0.5 h为最佳提取条件。提取时间大于1 h时，大豆皂苷B的总浓度并没有显著增加(图7)。之所以在确定提取条件时考虑了大豆皂苷g，是因为我们的目标是测定大豆中天然存在的DDMP大豆皂苷B浓度。

DDMP大豆皂苷Bs在大豆提取物中的热稳定性

图8为不同贮藏温度(4℃、20℃、30℃)下大豆皂苷g的表观一级速率常数。结果表明，随着贮藏温度的升高，大豆皂苷g降解速度加快。结果表明，在4℃、20℃和30℃条件下，大豆皂苷g的表观一级速率常数(k1)分别为2.3times;10 - 2、9.4times;10 - 2和1.27times;10 - 1 h-1。更重要的是，本研究证实，大豆皂苷g在30°C储存小于4h、20°C储存小于5h、4°C储存小于48h时，其降解无统计学意义。大豆皂苷a与so的降解规律相同

图5室温提取体积为40ml 80%甲醇时，提取时间对大豆皂苷g的影响。yasaponin g

资料编号：[5172]

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