小檗碱通过Perk介导的Nrf2/Ho-1信号轴改善脂多糖诱导的急性肺损伤外文翻译资料

 2021-12-22 10:12

小檗碱通过Perk介导的Nrf2/Ho-1信号轴改善脂多糖诱导的急性肺损伤

Yuan Liang1,2dagger; | Chongxi Fan3dagger; | Xiaolong Yan4dagger; | Xi Lu1 | Hua Jiang1 | Shouyin Di4 | Zhiqiang Ma4 | Yingtong Feng4,5 | Zhengbin Zhang6 | Pan Feng6 | Xiao Feng6 | Jianyu Feng6 | Faguang Jin1

1第四军医大学唐都医院呼吸科，西安2中国人民解放军昆明总医院呼吸科，中国昆明第四军医大学生物医学工程系，西安4第四军医大学唐都医院胸外科，西安5中国人民解放军第97医院心胸外科6，第四军医大学西京医院心血管外科6，西安，中国函授金光光，第四军医大学唐都医院呼吸科，西安市新四路1号，710038电子邮件：jinfag@fmmu.edu.cn资助信息国家自然科学基金，授予/奖励编号：81702731,81700264和81570230;陕西省自然科学基金，拨款/奖励编号：2018SF-159;军事卫生研究项目，拨款/奖励编号：14BJ255;中国国家重点研究发展计划，拨款/奖励编号：2016YFC1301900;南京军区医学科技创新学科，授予/奖励编号：15MS043

1.|介绍

急性肺损伤（ALI）是一种严重的临床病症，可能导致急性呼吸衰竭和死亡，其特征是呼吸窘迫，难治性低氧血症和非心源性肺水肿（Wheeler＆Bernard，2007）。在病理学上，ALI被认为是一种急性严重的炎症过程，其特征是广泛流失上皮和内皮完整性（Ware＆Matthay，2000）。气道上皮细胞是将宿主的内部环境与外界隔开的重要结构，它不仅是外部刺激和微生物的机械屏障，而且还积极参与先天和后天的免疫反应和气道炎症（Rubenfeld等，2005） ）。严重脓毒症是ALI的主要原因。此外，源自革兰氏阴性细菌外膜的脂多糖（LPS）可诱导肺和气管上皮细胞出现急性炎症的特征，包括白细胞介素（如IL-6和IL-8）的上调和下游分子途径的调节。虽然在理解ALI的病理生理学方面取得了重大进展，但只有支持性治疗降低了ALI相关的死亡率（Matthay，Ware，＆Zimmerman，2012）。因此，新药和抗过度炎症的新治疗策略是预防ALI的当务之急。

小檗碱是许多流行药用植物的主要异喹啉生物碱成分（例如小檗，黄连和Hydrastis等;图1a），由于其各种生物活性，包括止泻，抗癌，历史上一直用于中药。抗糖尿病，抗高血脂和心脏保护作用（Menees，Saad，＆Chey，2012; Pirillo＆Catapano，2015; HL Tan等，2016; W. Tan，Li，Chen，＆Wang，2011）。值得注意的是，小檗碱因其在体外和体内的抗炎活性而引起了相当大的关注（Caliceti，Franco，Spinozzi，Roda，＆Cicero，2016; Seo，Fischer，＆Efferth，2018; Xie＆Du，2011）。然而，考虑到小檗碱的广泛药理作用和ALI的复杂分子机制，小檗碱对LPS诱导的ALI的保护作用需要进一步研究。

内质网（ER）是与周围细胞质分离的单一脂质双层，构成广泛的管状网状网络（Oakes＆Papa，2015）。ER是关键的真核细胞器，负责分泌和跨膜蛋白的合成和折叠（Todd，Lee，＆Glimcher，2008）。在这些过程中，ER中未折叠和错误折叠的蛋白质的过度积累激活了称为未折叠蛋白质反应的进化反应，并破坏了能量/营养物质平衡，也称为ER应激（Hetz，2012）。为了在ER应激期间维持和改善ER功能，激活三种膜蛋白传感器，包括需要肌醇的1alpha;，蛋白激酶R样ER激酶（PERK）和激活转录因子6（Hetz，2012）。这些蛋白质有一种通过与葡萄糖调节蛋白78结合而保持在无活性状态的腔传感器/换能器结构域（GRP78; Pincus等，2010）。最近的研究表明，ER应激，特别是PERK途径，涉及体外不同病因的肺损伤，包括LPS诱导的肺泡和烟雾诱导的气道上皮损伤（Hrincius等，2015; SR Kim等，2015年）。此外，虽然小檗碱负调节多系统炎症性疾病中的ER应激，但小檗碱对LPS诱导的ALI的保护作用仍不清楚。

核因子 - 红细胞2相关因子2（Nrf2）转录因子是一种独特的Cap#39;n#39;Collar- 碱性亮氨酸拉链转录因子，目前被认为是细胞稳态的主要调节因子，通过Nrf2与其结合来实现。最突出的抑制剂 ，Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1; Ma，2013）。在肺组织中，Nrf2主要存在于上皮细胞中，其与多种肺部疾病有关，例如急性呼吸窘迫综合征（ARDS），肺纤维化，哮喘和慢性阻塞性肺病。最近，据报道小檗碱通过Nrf2活化增强抗氧化剂的作用，并减少博来霉素诱导的炎症反应，组织学改变和胶原沉积（Chitra，Saiprasad，Manikandan，＆Sudhandiran，2013）。重要的是，Cullinan等人。表明PERK可能参与介导心肌缺血再灌注损伤中的Nrf2磷酸化和易位Diehl，2004）。总的来说，考虑到ER应激和Nrf2对感染和炎症过程的贡献，这些因子在LPS诱导的ALI中可能的相互作用正在成为感染性肺病的致病成分。此外，因为小檗碱可以调节一些炎症相关疾病中的ER应激或Nrf2

在本研究中，我们首先阐明了ER应激或Nrf2在小檗碱对体外和体内LPS诱导的ALI的保护作用中的作用。然后，我们使用特定的小RNA干扰序列和人气道上皮细胞系（16HBE）中的激动剂，专注于ER应激和Nrf2之间的联系。因此，这些发现表明小檗碱对LPS诱导的ALI具有新的保护作用，并鉴定与PERK-Nrf2轴调节相关的炎症相关机制。

|材料和方法

    1. |试剂和化学品

盐酸小檗碱（C20H18ClNO4），LPS（来自大肠杆菌055：B5的脂多糖），毒胡萝卜素（Tg），萝卜硫素（SF），4#39;，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） ）和戊巴比妥钠购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）。新生小牛血清（NBS），0.25％胰蛋白酶-EDTA，RPMI-1640培养基和磷酸盐缓冲盐水（PBS）获自Gibco Laboratories（Life Technologies，Inc.，Burlington，ON，Canada）。CCK-8测定试剂盒购自Dojindo Laboratories（Tokyo，Japan）。针对人PERK和非靶mRNA的小干扰RNA（siRNA）获自Qiagen（Hilden，Germany）。Nrf2 siRNA购自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。本研究中使用的一抗是来自Abcam（Cambridge，MA，USA）的磷-Nrf2（p-Nrf2），Nrf2，血红素加氧酶1（HO-1）和GRP78。来自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）的磷酸-PERK（p-PERK）;PERK，磷酸-eIF2alpha;（p-eIF2alpha;），真核翻译起始因子2（eIF2alpha;）的alpha;-亚基和来自Cell Signaling Technology（Beverly，MA，USA）的C / EBP同源蛋白（CHOP）;和来自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）的Lamin B1和beta;-肌动蛋白。Cy3-AffiniPure山羊抗兔和AlexaFluorreg;488AffiniPure山羊抗小鼠二抗从益生生物技术有限公司（中国上海）获得。辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗从中山生物技术有限公司（中国北京）获得。BCA蛋白质测定试剂盒由Pierce Biotechnology（Rockford，IL，USA）提供。用于人炎症蛋白IL-6和IL-8的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自R＆D Systems（Minneapolis，MN，USA），以及用于小鼠IL-6和角质形成细胞衍生细胞因子（KC;小鼠IL-8当量）购自Neobioscience（深圳，中国广东）。Transam TM Nrf2试剂盒购自Active Motif（卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）。细胞毒性检测试剂盒（乳酸脱氢酶，LDH）和蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Roche Molecular Diagnostics（Pleasanton，CA，USA）。Lipofectamine RNAiMax转染试剂和TRIzol试剂均为购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。primescriptrade; rt购买Master Mix和TB Greentrade;Premix Ex Taqtrade;II Takara Bio Inc.（日本滋贺县草津）。Wright-Giemsa和Evans蓝染料购自Solarbio Life Sciences（中国北京）。MPO检测试剂盒来自南京建成生物工程研究所（中国南京）。活性氧（ROS）测定试剂盒，放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液，核和核细胞质蛋白质提取试剂盒购自Beyotime Institute of Biotechnology（Haimen，China）。

|细胞培养

人支气管上皮细胞系（16HBE）购自American Type Culture Collection（Manassas，VA，USA），并在补充有10％NBS，100单位/ ml青霉素和100mg / ml链霉素的RPMI-1640培养基中培养。在37℃下含有5％二氧化碳 和95％氧气的潮湿气氛。每24小时更换培养基。在整个实验中使用经历少于20次传代的细胞。

|细胞刺激

首先，使用一系列小檗碱浓度（0.25,2.5,25或250mu;M）24小时以确定用于进一步实验的最佳非细胞毒性剂量。接下来，在LPS刺激（100ng / ml）之前将16HBE细胞用不同剂量的小檗碱处理4小时另外24小时。还应用Tg（1mu;M）或SF（4mu;M）处理4小时来研究ER应激或Nrf2在小檗碱对LPS诱导的ALI的保护作用中的作用。

|CCK-8测定

为了确定活细胞的数量，使用CCK-8试剂盒测量甲dye染料的产生。在不同处理后，将16HBE细胞用CCK-8溶液在96孔板中处理，然后将板在含有5％CO2 和95％O2 的潮湿气氛中于37℃温育2小时。小时。使用酶标仪（SpectraMax 190，Molecular Device，Sunnyvale，CA，USA）测量450nm处的吸光度。

|LDH测定细胞毒性

根据先前的研究（Hardyman等人，2013），通过商业测定试剂盒在细胞培养物上清液中定量LDH（细胞膜损伤的指示剂）来测量小檗碱的细胞毒性。在用1％Triton X-100溶液作为阳性对照处理后收集的16HBE细胞裂解物中测定总细胞LDH释放。相应地，未处理的细胞用作阴性对照。

|Nrf2-抗氧化反应元件结合试验

基于ELISA的DNA结合试验用于研究小檗碱对LPS诱导的急性气道炎症细胞模型中Nrf2的DNA结合活性的影响，根据公布的报告和操作说明书（Guan et al。，2013） 。简而言之，将16HBE细胞刮入冰冷的低渗缓冲液（20-mM HEPES，5-mM NaF，10-mu;MNa2MoO4和0.1-mM EDTA，pH 7.5，将其溶于50ml蒸馏水中，在4℃保存并孵育持续20分钟在4℃下离心30秒后，除去上清液（主要是细胞质级分），将核沉淀重悬于50mu;l完全裂解缓冲液中并摇动轻轻地在冰上30分钟。将悬浮液在14,000g和4℃下再离心10分钟，并将上清液（主要是核提取物）储存在-80℃，避免冷冻/解冻循环。ELISA试剂盒包括96孔板，其中固定有含有抗氧化应答元件（ARE）共有结合位点（5#39;-GTC ACA GTG ACT CAG CAG AAT CTG-3#39;）的寡核苷酸。向每个孔中加入总共40mu;l完全结合缓冲液，然后加入20mu;g核提取物。盖上板并在室温下摇动（100rpm）1小时。随后，分别加入Nrf2抗体（1：1,000）和辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（1：1,000）并在室温下温育1小时。在酶标仪（SpectraMax 190，Molecular Device，Sunnyvale，CA，USA）上在450nm处读取吸光度（L.Wang等人，2017）。

|RNA提取和实时定量聚合酶链反应测定

如前所述进行总RNA分离和实时聚合酶链反应（PCR）（Li等人，2016; Yao等人，2017）。简而言之，用不同剂量的小檗碱（2.5,5或10mu;M）处理16HBE细胞4小时，然后用100ng / ml LPS处理24小时。用TRIzol试剂从细胞中分离总RNA。分离后，根据制造商的说明，在NanoDrop2000分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）上评估RNA质量。260/280的吸光度比为1.8-2.0表示纯RNA样品。用oligo-dT进行逆转录以引发逆转录反应，用于扩增cDNA的炎性基因的引物列举如下：IL-6,5#39;-ATG TAG CCG CCC CAC ACA GC-3#39;（正向）和5#39;-CAT CCA TCT TTT TCA GCC AT-3#39;（反向）;IL-8,5#39;-ACT GAG AGT GAT TGA GAG TGG AC-3#39;（正向）和5#39;-AAC CCT CTG C​​AC CCA GTT TTC-3#39;（反向）;和GAPD

英语原文共 19 页

资料编号：[3959]

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