层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA导管与雪旺神经干细胞联合移植修复喉返神经损伤外文翻译资料

 2022-01-27 08:01

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层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA导管与雪旺神经干细胞联合移植修复喉返神经损伤

摘要:

本课题研究的目的是评估利用层粘连蛋白-壳聚糖-聚乳酸-共聚乙醇酸(又称层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA)、神经导管和神经干细胞联合移植修复周围神经缺损的可能性和有效性。先前的体外实验证明，电纺丝法构建的层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA神经导管三维结构有利于神经细胞的迁移和再生，具有显著的机械强度和可塑性。与其他生物及合成材料相比，它能够在神经组织再生过程中提供支持，一旦周围神经完成再生，它就可以自我降解。本研究采用132只雌性斯普拉格·道利大鼠建立喉神经损伤动物模型，随机分为6组进行实验。制备好的神经导管与雪旺和神经干细胞共培养，采用显微外科技术修复5毫米长的喉返神经损伤。术后8周和12周分别进行功能和组织学检查。结果表明，层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA神经导管联合雪旺和神经干细胞能促进神经再生(Plt;0.05)，其效果优于自体移植(Plt;0.05)。本研究结果表明，这是一种理想的修复周围神经缺损的方法且移植细胞可促进神经再生。

介绍：

自体神经移植长期以来被认为是周围神经缺损修复的金标准。但由于供体材料的限制、供体区功能的限制、感觉轴突错位的生长、轴突分散再生以及免疫抑制治疗的需要等因素，严重限制了其临床应用。由于存在这些局限性，因此需要寻找一种可以修复神经缺损和优化受损神经功能恢复的替代方法。研究人员已经测试了多种技术和材料，其中一种选择是使用同种异体移植。由天然或合成材料制成的神经导管结构复杂，在三维结构和生物活性方面存在一定的缺陷。神经导管已被证明是最有希望的方法，以桥接的方式修复受伤的周围神经。例如，Meek等人使用聚乙醇酸神经导管治疗了136例神经损伤患者。患者表示，修复过程优于端端神经移植手术；然而，修复的长度要求要小于3厘米。Suzuki等人使用冷冻干燥的海藻酸盐导管修复了50毫米猫坐骨神经缺损，术后组织学检查发现新生的神经束，且神经导管完全降解。

雪旺细胞和神经干细胞在周围神经损伤的修复和再生中具有重要作用。神经干细胞能够在体外和体内移植条件下增殖分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。雪旺细胞可以分泌多种神经生长因子、神经营养因子、神经突生长因子，为神经再生提供营养，促进轴突再生，因此被广泛应用于神经修复的实验研究中。一项神经干细胞体外培养实验发现，虽然神经干细胞能够分化为神经细胞，但绝大多数分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞，很少形成神经元。一项使用体外与雪旺细胞共培养的大鼠神经干细胞的研究表明，共生细胞和雪旺细胞都能促进神经干细胞向神经元样细胞分化。据推测，这可能与雪旺细胞分泌的神经营养因子相互作用有关，包括神经生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子和碱性成纤维细胞生长因子。郭等实验证明NT - 3修饰的神经干细胞与神经干细胞共移植相比，单独移植神经干细胞或神经干细胞能更好地促进脊髓损伤的神经存活和轴突再生。在临床上，损伤神经的修复需要神经干细胞比平常更加快速地分化成神经元，而且分化良好的神经元在胶质细胞增殖、突破损伤区域并与周围神经细胞建立联系之前存活并迅速增值。雪旺细胞能够分泌多种神经营养因子，这些物质可以诱导轴突建立、延长和抑制胶质瘢痕的形成。此外，雪旺细胞可以促进损伤的神经修复组织的结构和功能，因此将其与神经干细胞共移植可能有助于修复周围神经损伤。

实验结果表明，雪旺和神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤具有良好的疗效。夏等人将两种细胞培养到定向PLGA支架中，并将其移植到大鼠脊髓半切模型中。结果表明，该支架为神经干细胞的再生提供了良好的环境，并促进了轴突的再生、髓鞘的形成和运动功能的恢复。陈等人经研究证明，移植的神经干细胞能够在大鼠脊髓损伤后存活并迁移长达24周，并能够分化成各种神经细胞。细胞/PLGA联合移植可促进损伤脊髓的功能恢复，且PLGA联合移植神经干细胞和雪旺细胞的效果优于单纯PLGA联合移植。

基于上述研究，我们推测神经导管与雪旺细胞和神经干细胞共培养能够促进喉返神经损伤的再生。为了验证这一假设的可行性，我们将层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA神经导管与雪旺和神经干细胞联合应用于SD大鼠喉神经损伤的桥接，并评估不同时间点神经结构和功能的再生效果。

材料与方法

实验动物：生长了132,40天的雄性SD (SD)大鼠(重~ 150克),由上海交通大学第一人民医院(上海,中国)实验动物中心提供,被用来建立喉神经损伤的动物模型,随机分为六组(每组22只)；用层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA神经导管(Co)共培养神经干细胞和雪旺细胞；附在神经导管的雪旺细胞(SC)；具有神经导管的神经干细胞；神经导管(空)；自体神经移植物。大鼠维持在12 h光照/暗循环下，随机给予鼠粮和水。恒温18°C-23°C，湿度40-70%。所有大鼠实验方案均经上海交通大学医学院附属上海总医院伦理委员会批准。所有手术均在无菌条件下进行，全身麻醉后，腹腔注射10%的三氯化氢(400 mg/kg；(1 .国药控股化学试剂有限公司，上海)。

细胞培养：将由上海交通大学第一人民医院实验动物中心提供10只3 ~ 5天龄的Wistar大鼠(性别比例为1:1)，置于12 h光照/暗循环下，随机给予鼠粮和水。恒温18-23°C，湿度40-70%。大鼠死亡后，在显微镜下取坐骨神经外膜，用眼科剪刀将外膜切成小块。原代培养采用酶消化法，将培养物纯化至第二代，室温下用S100染色2 h 。

采用上海交通大学第一人民医院实验动物中心14日提供的2只SD大鼠(体重220克左右)进行剖宫产。大鼠维持在12 h光照/暗循环下，随机给予鼠粮和水。恒温18-23°C，湿度40-70%。取胚胎取出并灭活，分成两半，摘除脊椎嗅球。倒置显微镜下观察间脑、小脑和剥脱的血管膜(放大倍数，x20)。将左侧大脑皮层和两侧海马分别置于含有神经干细胞培养液的15 - ml离心管中[NSCM；DMEM / F12 (1:1；Gibco；]， 2% B - 27补充剂除去AO， 20 ng/ml表皮生长因子，20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子， 50x L -谷氨酰胺；并将其转移到另一个15 ml离心管中，移至单细胞悬液中。随后用40 -micro;l筛网过滤器逐步过滤并在NSCM上接种密度为 每瓶1 x105 /毫升。在37度恒温恒温箱中5% 的CO2孵育2天后，NSCM将会变性。用巢蛋白标记神经细胞。

神经导管的制备：壳聚糖涂层PLGA导管由东华大学提供。本研究课题在神经导管内径0.6 mm、管壁厚度0.2 mm、长度为2 cm处构建了10根纳米纤维长丝。

采用3.5%的果壳糖浆，因为其粘度低，不易渗透到纱线中。壳聚糖糖浆的组成如下:3.5%壳聚糖(BBI生命科学，上海，中国)，4%乙酸和92.5%蒸馏水。将11厘米长的纤维导管两端用两个金属夹固定，分别浸入0.1%壳聚糖中，在室温保持30分钟。用细刷轻轻清理神经导管表面。随后去除多余的果壳糖浆，在室温下干燥神经纤维导管。材料在70度的恒温烘箱中烘干15分钟以便定型(常州纺织仪器厂有限公司，(常州)。待涂层干燥固定后，轻轻拉出导管芯轴，按照实验要求将导管剪成7 - mm的片段，进行消毒。导管密封保存，在冰箱中恒温保存。

将壳聚糖- PLGA导管在PEI溶液(1mg /ml)中浸泡20 min，在自来水中冲洗2次。然后将导管浸泡在0.2 mg/ml的层粘连蛋白(LN)溶液中20 min，再用自来水冲洗2次。由此形成了一层聚乙烯亚胺/液氮 (PEI/LN)双层膜。重复这些步骤可以在PLGA管表面形成多层PEL/LN膜。为了保持LN的活性，整个过程在(0°C)冰浴中进行。

手术处理：将132只SD大鼠分为CO组、SC组、NSC组、空白组、自体移植物组和假设组，均在右侧RLN作双侧切口。将所有大鼠在无菌条件下腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)。随后将每只老鼠放在手术台上，用剃刀刮掉它们的颈毛。将手术区皮肤消毒，沿颈部中线用手术刀切开2厘米长的切口，露出皮肤和皮下组织。用弯曲止血器切开前肌，露出喉部和气管环。随后，将位于气管食管沟内的~ 1cm RLN露出并分离。用显微外科剪刀切取5毫米长的中分离神经节段。

在CO组神经节段远端插入1 mm的层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA神经导管，然后用10 - 0缝线缝合神经导管和神经节段。将22.5micro;l基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国),3.75micro;l雪旺细胞(~ 0.083 x106细胞),和3.75micro;l神经干细胞(~ 0.083 x106细胞)的混合物注入到神经导管中。用同样的方法处理神经的近端，使导管的两个断端之间保持5毫米的距离。

SC组采用与CO组相同的方法。唯一的变化是将22.5micro;l人工基底膜和7.7micro;l雪旺细胞(~ 0.167 x106细胞)的混合物注入到神经导管中。NSC组采用与CO组相同的方法，唯一的变化是将22.5micro;l人工基底膜和7.7micro;l神经干细胞(~ 0.167 x106)的混合物注入导管中。在空白组,只将30micro;l人工基底膜注入导管中。在自体移植组中，将5 - mm神经段近端和远端互换，缝合相应的神经外膜。在假设组中，解剖后RLN位于气管食管旁，不行进一步手术。

电生理检查：将每组10只的SD大鼠于术后第8周和第12周进行分析研究。完成麻醉诱导(10%水合氯醛麻醉)后，切开前正中切口，露出右侧的RLN。将刺激电极(双极刺激电极)置于再生神经近端，记录电极经环甲膜插入甲状腱肌中部。使用美敦力公司(美敦力公司，明尼阿波利斯市，明尼苏达州，美国)的关键点肌电图机记录波形，并计算和比较潜伏期和振幅。

电镜检查：在术后8周和12周，每组随机抽取1只SD大鼠进行甲苯胺蓝染色和透射电镜观察。完成麻醉(10%水合氯醛)后，切断再生神经中间段，并在2.5%戊二醛中下固定2 h，恒温4度，再分级乙醇脱水，环氧树脂包埋处理。然后,将环氧-嵌入组织切成超薄部分(1micro;m)并使用柠檬酸染色；用电子显微镜观察髓鞘厚度和髓神经纤维直径。所有图像均使用IPP软件。

数据分析：所有数据均以均数plusmn;标准差表示，采用GraphPad Prism软件进行统计分析。采用等标准差的非配对t检验检验两组样本在不同时间点的差异。若Plt;0.05则认为差异有统计学意义。

结果：

细胞培养：之前的体外实验结果显示，雪旺细胞呈S100阳性(绿色)，成纤维细胞仅呈蓝色DAPI染色(14,28-30)。当传代至P2代时，只有雪旺细胞可见，很少甚至没有成纤维细胞。显微镜下P2代神经干细胞呈nestin阳性(红色)，可见神经干细胞形成悬浮球，无粘附生长。这表明雪旺和神经干细胞的培养是成功的。

动物模型：每组的手术都很成功。术后喉镜检查显示，手术一侧声带不动，另一侧运动良好，动物模型建立成功。所有实验动物都存活下来，没有任何并发症，包括感染。手术伤口愈合得很好。

神经导管：术后8周和12周再次露出手术区域，观察RLN导管桥接缺损。在8周时，所有实验组的导管均出现变薄的现象，神经导管表面可见少量血管膜，导管与周围肌肉之间未见粘连。

第12周时，CO组神经导管被纤维结缔组织包裹，与周围组织无粘连。导管会逐渐变薄，表面有新形成的毛细血管，神经组织连接完好。纵向切开导管发现新生的RLN连接近端神经和远端神经末梢。再生导管中部直径略小于正常神经。神经连接未见明显瘢痕或肿胀，未见神经导管体瘤变。

喉部肌肉和甲状肌腱松解后未见明显萎缩。神经干细胞组局部肿胀，周围有纤维结缔组织。自体移植组有轻微的粘连，神经吻合通畅，无肿胀现象。移植神经较为完整，质地柔软。

电生理评价：手术后8周和12周甲状腺腱肌肌电图(EMG)检测结果见图5-8。CO组振幅低于假设组(Plt;0.0001；图7)；与其他各组比较，差异有统计学意义(Plt;0.01；图7)。12周时CO组的振幅恢复到假设组的70%。在第8周和第12周时，CO组的潜伏期更长(Plt;0.0001；图8)与假设组比较，手术时间较假设组短(Plt;0.05；图8)。

电镜检查：术后8周和12周的电镜检查结果见图9和图10。术后8周时，CO组出现大量再生神经纤维，它们有较厚的髓鞘，连接处之间的结缔组织较少。再生髓鞘发育良好，厚度均匀。再生轴突发育良好，排列有序。SC组和空白组再生神经纤维较小；它们分散、扭曲、不规则，髓鞘较薄。NSC组导管内可见大量结缔组织、炎性细胞、核碎裂、未被吸收的基质凝胶，但是却没有观察到明显的新生髓鞘。CO组再生髓鞘明显较其他组厚；然而，与自体移植组和假设组相比，CO组的鞘层更薄。

结论：

为了解决周围神经缺损，各种材料，包括胶原蛋白、丝、纤维素、静脉、肌肉等制造神经导管已被用来解决神经损伤所带来的问题；然而，目前还没有一种有效的神经移植物替代物可以广泛应用于临床。本研究采用的层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA神经导管由东华大学研制。特定的热凝固工艺使导管结构更加稳定，内嵌纳米纤维丝支撑导管，因此导管具有一定的抗压强度和弹性。初步结果表明，层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA与雪旺细胞和神经干细胞具有良好的黏附性。LN蛋白是细胞外基质的主要成分之一。近年来，研究器官发育的领域有文章报道LN蛋白能够诱导胚胎干细胞和神经干细胞的分化，这说明层粘连蛋白-壳聚糖- PLGA导管是修复周围神经损伤的良好选择。

以往的实验结果表明，肌电图可用于评价神经再生程度，因为肌电图的振幅与肌纤维的数量有关。如果神经受到损伤，部分神经纤维将无法传递神经电信号，会影响振幅和潜伏期。RLN损伤后波形幅度与损伤程度成正比；也就是说，神经损伤越严重，振幅越小，以至于没有观察到波形。然而，潜伏期与神经损伤程度是成反比的。目前的实验结果表明，除SHAM组外，CO组的振

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