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基于三重态敏化上转换的体内比率纳米温度计
Ming Xu1, Xianmei Zou1, Qianqian Su1, Wei Yuan1, Cong Cao1, Qiuhong Wang1, Xingjun Zhu1,Wei Feng1amp; Fuyou Li1
对于复杂的生命活动通常依赖于温度的生命系统来说，温度是一个重要的因素。基于非接触式光学方法的活体温度测绘有助于揭示生物体内的生理现象，尽量减少对生物体的影响。本文首创了一种基于三重态-三重态湮没(TTA)机制的高热敏上转换系统，能够灵敏地指示体温在生理温度范围内的变化。近红外发射的温度不敏感的NaYF4:Nd纳米磷酸盐被纳入温度响应的TTA上转换系统作为内部校准单元。因此，我们研制了一种比率温度计，能够准确地监测体内温度的变化，具有高的热灵敏度(~7.1%K-1)和分辨率(~0.1K)。
发光纳米热量计因其在纳米医学、微流体学、纳米电子学和集成光子器件等领域的广泛应用而受到广泛关注。鉴于这种高灵敏度纳米计在相关领域，特别是在诊断和治疗方面具有革命性的巨大潜力，因此开发这种新型纳米计具有重要意义。近年来，体内温度监测被认为是生理学、医学诊断和可控热疗研究的有力工具。基于发光成像的非接触式测温技术提供了一种非侵入性和可观测的方法来绘制体温-。值得注意的是，基于反斯托克斯过程的上转换可以避免生物体系的自发荧光，是一种很有前途的体温计在体内发展的技术。在这种情况下以掺镧系元素的上转换纳米磷酸盐(UCNPs)为基础，研制了几种温度计。然而，基于UCNPs的温度计一般表现出中等的热灵敏度(lt;1.6%K-1)和分辨率(gt;0.5K)，以及较低的发光效率。因此，迫切需要一种能够监测体内微小温度变化的高灵敏度温度计。
三重态三重态湮没上转换作为最有效的反斯托克斯过程，具有潜在的热敏性。TTA上转换涉及到零化子和敏化剂二极体中的多重能量转移。直观上，TTA-upconversion需要扩散的组分生色团，这是敏感的小温度变化。然而，基于TTA上转换技术的体内温度计的实例尚未报道，这种技术面临着诸如不规则的温度响应或生理环境中的低热敏感性以及严重的浓度依赖性等重大挑战。
在此，我们设计了一个优化的TTA二极体来探索体内测量的方法。在较高的温度下，发色团的扩散速率和碰撞概率的提高导致TTA-upconversion-的急剧增强。在我们的设计中，上转换发光(TTA-UCL)与非辐射失活的抑制一起，在生理温度范围内正相关(补充图1)。为了最大限度地减少生物环境的影响，并使指示信号的输出与浓度无关，TTA二极体被封装为热不敏感的内部标准(补充图2)。参考文献显示了第二个生物学指标的NIR发射，该指标也适用于生物成像。因此，比率温度计被实现为TTA-Nd-NPs(图1).通过对组织温度分布的精确测量，以及对炎症引起的小鼠体温变化的检测，证明了TTA-Nd-NPs在体内温度测量中的潜在应用价值。这项工作对于上转换、温度测量、纳米医学和生命科学等广泛的研究领域具有重要意义。
图1基于TTA-Nd-NPs的体内比率测温示意图。TTA-upconversion对温度变化敏感。在内部参考的帮助下，校准的TTA-UCL信号能够对小动物进行精确的温度监测。b含有BDM(TTA湮灭剂)和PtTPBP(TTA敏化剂)的TTA生色团的化学结构和Nd3 纳米磷酸盐的示意结构(参考文献)。牛血清白蛋白:系统间杂交，TTET:三重态-三重态能量转移，TTA:三重态-三重态湮灭
结果
TTA系统升级:停用抑制。在筛选可能的TTA温度指示系统方面，光稳定和有效的BODIPY和PtTPBP双极是提出的候选者。显然，传统BODIPY湮灭器(例如BD)顶部的苯环可以自由旋转以消耗能量，从而导致明显的热失活(图2a)。高温扩散增强是TTA上转换过程的正向因素，而热失活是负向因素。失活因素与扩散因素之间的竞争效应可能会导致TTA系统的不规则热响应。如图2b所示，在40°c时，BD和PtTPBP在石蜡油溶剂中的TTA-UCL信号表现为正-负转变。在较高温度下，正扩散效应增强的TTA-UCL甚至被负猝灭效应压制，在40℃以上产生相反的热响应。由于热失活引起的猝灭效应，一种灵敏的体内tta温度计的研制仍然具有挑战性。
我们采取了一个简单而有效的策略，以减轻失活效果，使用旋转抑制BDM作为零化子(补充图3)。结构修饰对紫外-可见吸收影响较小，但可使荧光增强1.6倍(补充图4)。此外，在热失活荧光的显着缓解被观察到(图2a)，相当于正扩散效应的放大。值得注意的是，我们的设计推动了热敏TTA系统的极限，通常需要相变或聚合物链软化来提高扩散效果。因此，对于BDM和PtTPBP直接在液体溶剂中，TTA-UCL在10~60℃范围内得到连续增强(图2b)。因此，这一发现为增温TTA系统提供了一个新的前沿领域。
图2在TTA系统中实现高正热响应的策略。a 结构修饰，从而抑制荧光的热失活。b BBDM和PtTPBP以及BD和PtTPBP分别发出的TTA-UCL信号的温度响应。当负失活效应被抑制时，正扩散效应变得更加强大，从而产生高灵敏度的正温度响应趋势。激发光源为635nm激光(100mWcm-2)。BDM、BD、PtTPBP和l-抗坏血酸-6-棕榈酸酯在石蜡油溶剂中的浓度分别为110-3M、110-3M、510-5M和1mgmL-1。
TTA系统升级:比率校准。BDM和PtTPBP在生理温度范围内的热响应是非常理想的。然而，TTA-UCL的校正工作在复杂的生物系统中进行温度测量还是必要的。为此，本文在TTA系统中引入了校准单元。TTA-Nd-NPs材料是在高压均质机中通过BDM和PtTPBP与beta;-NaF4:5%Nd(补充图5)的自组装制备而成。标定信号(Nd3 的4F3/2-4I11/2)与TTA-UCL的重叠最小，可以避免串扰效应(补充图2)。纳米复合结构的有机-无机TTA-Nd-NPs显示在透射电子显微镜图像直径约160纳米(补充图6)。Tta-nd-nps的流体动力学直径为165nm，在10-50℃范围内保持不变(补充图7)。此外，在生物相容性的研究中没有发现TTA-Nd-NPs材料有明显的毒性(补充图8)。
TTA-Nd-NPs中的TTA双极BDM和PtTPBP在室温下产生了17mu;s的绿色上转换发射(补充图9)和3.1%的绝对量子效率(详见方法)。TTA-Nd-NPs通过自然降温返回室温时，TTA-UCL强度呈持续下降趋势，而恒温对照组TTA-UCL强度始终保持不变(补充图10)。此外，TTA-UCL的热敏感性通过调节敏化剂的浓度比容易控制(补充图11)。结果表明，TTA-UCL光强与635nm激发功率密度呈二次线性关系，阈值激发强度为65mWcm-2（图3a）。在低于阈值的低功率激发下，零化子的三联体自发衰变为二次相关，这是双分子TTA-upconversion系统中的普遍现象。另外，在TTA-Nd-NPs中，Nd3 纳米磷酸盐的发光强度与激发功率密度呈线性关系（图3a）绝对量子效率为10.2%(详见方法)。在以下实验中，我们分别测量了635和808nm的耦合功率密度激发光因此设置超过阈值(gt;65 mW cmminus;2)，以确保两个发光过程中的线性制度。激光功率密度在100-200mWcm-2范围内是最佳的激励选择，可以在低功率区输出功率无关的信号(图3a)。通过对TTA系统的升级，从理论上解决了不规则(或不灵敏)的温度响应和浓度依赖问题，构造了基于TTA系统的比率探头的概念。
TT-Nd-NPs的比率响应。然后，对TTA-Nd-NPs的热敏性能进行了较为准确的研究。在双通道测试系统中测量了TTA-Nd-NPs的发光光谱，如图3b所示.在测量中，样品温度精确控制在(plusmn;0.1K)将热电偶置于样品溶液中，而不是置于试管表面(补充图12)。随着温度的升高，TTA-UCL强度迅速增强，呈二次趋势(图3c)。TTA-Nd-NPs(~12%K-1)中TTA-UCL的热灵敏度远高于报道的热灵敏度NaYF4:Yb，Er@NaLuF4UCNPs(~0.8%K-1)在10-50℃范围内(补充图13)。与此相反，TTA-Nd-NPs中Nd3 纳米晶的发射在小于0.03%K-1的斜率下缓慢下降(图3c)。实际上，由于Nd离子的低热敏感性，Nd离子的热响应性能较差。鉴于我们设计的TTA系统具有高温敏特性，并且具有温度响应特性，因此热不敏感的Nd3 纳米晶体可以作为内标设计。Nd3 纳米晶的吸收/发射与TTA系统的吸收/发射没有重叠，从而使TTA系统的性能不受影响。实际上，TTA系统的校准装置将来也可以升级，例如使用其他具有显著热灵敏度的以稀土离子为基础的核壳型纳米粒子，这可能有利于获得更好的比值测温性能。
在生物系统中，外源探针的发光通常取决于特定的生物分布(补充图14)。在此，比率纳米胶囊的策略被适当地用来解决这个问题。在理论上，TTA-Nd-NPs单个胶囊的TTA二极体和Nd3 纳米晶的发光比基本保持不变，保证了TTA-Nd-NPs胶囊的浓度独立输出。校准的TTA-UCL信号输出(TTA-UCL/IReference比值)并不随初始物质浓度(15mgmL-1)到极稀溶液浓度(0.9mgmL-1)的变化而变化，尽管TTA-UCL信号明显减弱，显示出明显的浓度依赖性信号输出(图3d).这些观察清楚地证明了比率探测的重要性。Tta系统的方法。此外，还研究了pH值在不同情况和组织中的变化，在pH值为5.0-8.0时，结果基本一致(补充图15)。此外，TTA-Nd-NPs探针稳定，可逆性好(补充图16)。这些特性使得TTA-Nd-NPs在不受生物环境干扰的情况下适合于体内温度成像。
图3 TTA-Nd-NPs的性质研究。a 在不同激发功率下TTA-Nd-NPs的双发射特性。TTA-UCL信号在540nm处达到峰值，参考信号在1060nm处达到峰值。插图:磷钨酸钠负染后TTA-Nd-NPs的透射电子显微镜图像。比例尺是200nm。b在精确控制的温度下，校准TTA-UCL测量装置的示意图。c 水溶液中TTA-Nd-NPs的热敏感性。在635nm(100mWcm-2)和808nm(100mWcm-2)激光作用下测量了光谱。插图:TTA-UCL(Em I，绿线)和参考信号(EmII，红线)的综合发射强度与温度的函数。d 室温下浓度对比率探测法(蓝线)和基于强度的探测法(绿线)的影响
基于TTA-Nd-NPs的体内比率测温。在生物成像系统中标定了TTA-Nd-NPs用于体内实际温度测定的标准曲线。（图4a）。组织模型中的模拟条件是活体皮下注射的类比(补充图17)，数据点被拟合成如下方程式R2 gt; 0.999, Ratio (ITTA-UCL / IReference) = 0.00375T2minus;2.12032T 300.47099)。然后，这个公式的适用性在一只活体小鼠的体温测量中验证了辐射曲线(补充图18)。实际上，TTA-Nd-NPs无需物理接触即可在原位显示皮下温度，优于传统的皮肤穿刺热电偶。相应地，热敏性曲线[SR(dRatio/dT)/Ratio]见补充图19。基于这些结果，热灵敏度高达7.1%K-1，分辨率高达0.1K，这是迄今为止所开发的体内温度计中最好的结果(补充表1)。
坦白地说，这个优秀的TTA-Nd-NPs温度计的弱点被揭示为绿色UCL信号的中等穿透深度(补充图20)。因此，在近红外光谱领域工作的温度敏感TTA-UC系统可能成为未来深层组织应用的一个有吸引力的突破。近红外发射敏化器作为参考，也可以简化系统的结构。
此外，还探讨了我们的体温计在体内的可能应用。一般来说，炎症反应与生物系统的生理紊乱有关，可能引起体温的变化。炎症表现在不同的过程，如缺血症状，身体创伤，微生物感染，药物诱导。此前，纳米热力学实验结果表明，缺血实验中的炎症过程可以导致小鼠体内特殊的热动力学。记住这些，我们打算建立一个化学诱导关节炎与角叉菜胶，并监测炎症为基础的温度波动直接(补充图21)。值得注意的是，我们证明炎症在关节炎模型是时间依赖性的，并伴随着温度变化(补充图22)。为了验证该方案的可行性，还研究了激发激光对热测量的可能影响。事实上，目前研究中的低强度激光照射可以将其对温度测量的影响保持在最低限度(补充图23)。这些观察得到了证实我们的探测器有望用于炎症模型的测温。
最后，以TTA-Nd-NPs为基础的温度计在炎症模式下进行测温。在此，用角叉菜胶诱导小鼠右腿轻度关节炎，另一只小鼠左腿正常作为对照。建立小鼠关节炎模型后，观察到小鼠右腿有轻微肿胀（图4c）。.然后用TTA-Nd-NPs温度计测量比温变化。如图3c所示，两条腿之间不同的发光比例被清楚地显示出来。比率测温法给出了温度分布和变化的清晰图表。根据标准曲线，关节炎区的温度高于正常区，平均相差在0.9k左右。这个结果与热成像相机的结果是一致的(补充图24)。此外，观察还表明，TTA-Nd-NPs几乎不受炎症区严格的微环境的影响，炎症区活性氧类相对丰富。因此，TTA-Nd-NPs探针能够在体内进行温度测量，准确
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