用于低温冻存的微流控技术外文翻译资料

 2022-06-16 09:06

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用于低温冻存的微流控技术

Young S. Song, Sang Jun Moon, Leon Hulli, Syed K. Hasan, Emre Kayaalp, and Utkan Demirci.

摘要：在整个低温冻存过程中最大限度地减少细胞损伤对提高整体结果至关重要。在加载和卸载冷冻保护剂（CPA）期间持续的渗透性休克损伤是低温冻存过程中细胞损伤的主要来源。我们引入了一种微流控的技术，在低温冻存过程中将细胞的渗透性休克损伤降至最低。这种方法允许我们在微通道中使用扩散和层流控制CPA的加载和卸载。我们提供了一个理论解释与传统的通过细胞膜运输构建的低温冻存方案相比，微流控技术如何最大限度地减少了渗透性休克损伤。最后，我们表示生物实验与提出的数学模型一致。结果表明，与传统的低温保存方案相比，我们的新型基于微流控技术的方法将解冻后细胞的存活率平均提高了高达25％。本研究中开发的方法为低温保存细胞提供了一个平台，使得解冻后的细胞具有更高的细胞活性和细胞功能。这种方法将微流控技术引入到生物储存的领域，为这些领域的未来发展打开了大门。

前言

近十年来，微流控体系已经在各种生物应用领域取得了重大突破，例如临床诊断，生物检测以及通过跨学科的方法进行载药等。[1-7] 特别是，微流控技术具有利用微尺度传输氛围的动态特性，它代表了一种操纵生物样本如血液、活细胞、DNA、蛋白质和小分子的新工具。[8-14] 微流控技术对生物防腐领域也有影响。[13,15-18] 例如，微通道最近被报道用于分离健康的精子细胞。[17]

此外，这种新方法被引入到在石英毛细管通道中进行卵母细胞的生物保存[18]以及将由冷冻保护剂（CPA）包裹的细胞悬液直接注射到液氮中进行冷冻保存。[13] 微流控技术在生物保存方面也有若干进展，例如电子显微镜栅格、低温环和尼龙环的使用可以使得尤其是在提高了传热速率的条件下保证生殖细胞冷冻保存的正常进行。[16,19,20]]

在世界各地，每天都有数以万计的细胞被储存，以用于医学和生物学的多种应用，包括抗体和蛋白质的生产以及血细胞、生殖细胞和组织的保存。[21,22] 在冷冻保存过程中，细胞或组织被冷却至零度以下，以终止其生物活性。 随后升温至生理温度。在传统的生物低温冻存过程中可能存在以下方式引起的细胞损伤：渗透压休克、脱水、细胞外或细胞内冰晶的形成。在这些方式中，渗透压休克可以在冻存前和解冻后这两个不同阶段观察到。已经反复的暴露于渗透压休克的细胞在冷冻和解冻过程中不太可能存活。在这里，我们引入了一种新的微流控技术，通过将渗透压休克降到最低来改善整体冷冻保存效果。

CPA在细胞冷冻前被加载并在细胞解冻后被卸载以降低由于细胞外或细胞内冰晶的形成所造成的细胞损伤。在传统的冷冻保存方案中，细胞在CPA加载和卸载过程中会经历一系列有害的不等渗情况。[15,23,24] 虽然最初的细胞损伤可能不足以导致细胞凋亡或细胞破裂，但是它仍然可能对细胞在生物保存过程的恢复和生存造成负面影响。[25] 了解渗透压休克在CPAs装载和卸载过程中对解冻后的细胞活性的影响是至关重要的。

在冷冻保存领域，大多数研究集中在由细胞内和细胞外冰晶的形成引起的“冷冻损失”。在这里，我们开发了一种可以影响冷冻保存的总体结果的新的样品制备步骤。在装载和卸载期间，CPAs和水透过细胞膜是由于细胞内和细胞外的CPA渗透压的不平衡。这直接导致了渗透性休克。[26,27] 在CPA加载过程中，细胞周围的CPA浓度突然增加，水从细胞中渗出而CPA渗入细胞。这阻碍了细胞基质和辅酶的正常运输机制，可能诱发代谢性休克。至于在CPA卸载阶段，细胞外CPA浓度的突然下降导致水渗入细胞而CPA渗出细胞，这可能导致细胞肿胀并由于机械损伤引发细胞凋亡或破裂。[28] 这些与细胞生物物理特征有关的运输现象对于低温保存的成功至关重要。在文献中已经报道了关于使用微通道进行CPA运输行为的一些研究。[29,30] 例如，Fleming等人利用微通道中的扩散现象从细胞中除去二甲基亚砜（DMSO）。[29] 为了开发优化的方案，我们需要更全面地了解这些跨细胞膜的运输现象。此外，必须解释突然传质所引起的渗透性休克与冷冻保存结果之间的相关性。

在当前的研究中，我们将微流控技术引入到生物储存领域，以在生物储存的加载和卸载步骤期间主动控制CPA的浓度。为了定量地了解渗透压休克和细胞膜运输之间的关系，我们在两个不同的尺度上进行了数值模拟：一个是用于细胞膜运输的微观尺度，另一个是用于微通道的宏观尺度。与其他生物医学实验室采用的标准生物储存方法相比，这种新方法将样品制备过程中的渗透压休克降至最低，并增强了解冻后的细胞活性。

材料和方法

微流控装置的制备

为了利用聚（二甲基硅氧烷）（PDMS，Dow-Corning）制造微通道，本研究采用软光刻技术。 在加入助粘剂（Micro Prime MS8011，Shin-Etsu）后，将光致抗蚀剂（SU-8 2000，Micro Chem）均匀地涂摸在硅晶片上。然后，将该晶片进行软烘烤，并通过将该晶片暴露于紫外光中而在该晶片上形成微通道的图案。将聚（二甲基硅氧烷）和固化剂（Dow Corning Sylgard 184硅酮弹性体试剂盒）以10:1的比例混合并倒在硅晶片模具上。 抽气后，将PDMS在80℃的烘箱中固化2小时。通过氧等离子体处理（Harrick等离子体）将固化的PDMS从模具中剥离并粘合到微载玻片（Corning）上。 将塑料PE管连接到装置上，并利用注射泵（World Precision Instruments）将CPA和细胞悬浮液注入微通道中。

细胞的制备和低温保存

Hep G2（人类肝癌细胞）细胞从ATCC（Manassas）购得并在加有10％FBS的DMEM培养基中培养（培养箱条件为37°C，5% CO2）。 Hep G2细胞以约80％的密度传代3-4次。我们进行了三次细胞活/死测试以获得相应的细胞活性。首先，在用胰蛋白酶处理细胞后，通过将细胞与溶于1ml PBS中的活/死染料试剂盒（0.5mu;l钙黄绿素AM和1.5mu;l乙二胺均二聚体-1，Molecular Probes）一起温育10分钟来测量初始细胞活性。同时，将细胞悬浮于PBS溶液中并将细胞密度保持在1times;106 ml-1。为了制备CPAs，将10％海藻糖脱水物和4％BSA溶解于PBS中，并将1,2-丙二醇加入到与其摩尔浓度相对应的CPA溶液中。将细胞溶液灭菌并放入装有注射泵的注射器中。在显微镜观察下，将Hep G2细胞悬液注入微流体装置。当细胞通过微通道后，进行第二次活/死测试。 将剩余的细胞置于冻存管中并在不使用特殊冷冻容器的情况下储存在冷冻机（-80℃）中一天。 第二天，将细胞在温水浴（37℃）中解冻并注射入微通道中以卸载CPAs。第三次活/死测试是用来表征解冻后细胞的活力。 此外，解冻后细胞的培养被观察到增殖了7天。 为了检查Hep G2细胞的功能性，使用代谢测定试剂盒（Vybrant cell Metabolic Assay Kit，V-23110，Invitrogen）检测解冻后细胞的代谢活性。

理论

物质通过细胞膜传输的微尺度模型

在过去的几十年里，细胞生物物理学领域已经开展了许多关于物质通过扩散作用在细胞膜上运输的基础研究。目前有以下几种模型：仅考虑溶质渗透率的单参数模型，考虑水和溶质渗透率的经典双参数模型，以及根据水和溶质渗透性之外的不可逆热力学来考虑溶质和溶剂之间的相互作用的三参数模型。[31-33] 三参数模型已被广泛接受为最接近模拟通过细胞膜的物质传递的模型。假设可渗透性CPA扩散进出细胞，水通道（水通道蛋白）和低分子量CPA通道可通过共转运相互作用。 在三参数模型（Kedem-Katchalsky模型）中，穿过膜的水和溶质运输通过使用反射系数在数学上耦合。根据反射系数，水和CPA通过共同通道传输。 这种数学模型可以提供对由于渗透压变化引起的细胞流体通量、体积变化和CPA摩尔浓度的深入了解。在目前的研究中，当细胞浸泡在CPA中时，分析渗透质量传递的演变。首先，穿过细胞膜的水通量表达如下[34,35]

其中Lp是膜的水渗透率，sigma;s是CPAs的膜反射系数，R是通用气体常数，T是温度，c是CPAs的浓度，A是细胞表面积，E是细胞弹性模量，Vw是细胞的含水量。 另外，上标i和e分别表示细胞内和细胞外。其次，CPA运输由以下公式模拟：

其中omega;是CPA的膜渗透性，Cup是根据水通量方向的CPA的上游浓度 采用四阶Runge-Kutta方法，用C 编程语言计算公式（1） - （5）。 本研究中使用的参数补充在表格S1中列出。

微流体流动的宏观模型

我们设计并制造了具有三个输入通道的微流体装置，其具有100mu;m高，100mu;m宽和1.5mu;m长的尺寸。微流体通道通过CPA的扩散提供沿通道的CPA浓度的无缝改变。由于通道非常狭窄和长，因此通道的数值计算需要大量计算能力，例如64位操作系统。 在这项研究中，我们进行了有限元模拟。 使用稳态Navier-Stokes方程模拟微流体通道中的流动行为如下：

其中rho;和eta;表示流体密度和粘度，它们被假定为CPA浓度的线性函数（混合规则）。 另外，u表示速度矢量，P是流体压力。假设CPA仅与水分子相互作用并且物理性质仅计算CPA浓度，则考虑单个物种的物质运输。CPAs的运输现象由以下对流和扩散方程稳定状态决定：

其中c是CPA的浓度，D是CPA的扩散系数。作为边界条件，在入口处施加平均速度，其在微流体通道中产生层流。在出口处，压力被设定为零（大气压力）。另外，对所有其他边界应用无滑动条件（u = 0）。对于质量平衡，浓度边界条件被赋予入口。另外，在出口处施加对流通量条件，这意味着出口表面的法线方向的质量扩散可以忽略不计。

结果与讨论

生物储存包括三个主要阶段：（1）CPA的装载; （2）冻存：冷冻储存和解冻;（3）CPA的卸载。我们引入了一种微流体装置（图1A）来帮助低温保存（图1B），首次提供了以受控渐进方式增加和降低CPA浓度的能力。为此，微流体通道有两个输入口：一个用于细胞，另一个用于CPA。 如图1A所示，细胞注入通道的中间。CPA同时从两边流入微流体通道。 随着细胞沿着通道向下移动，由于CPA浓度的差异，CPA向中心扩散（扩散长度）。因此，沿着微流体通道传播的细胞经历CPA浓度的逐渐变化，从而使渗透压休克减小。通过调节CPA和悬浮在PBS中的细胞的流速，我们可以主动控制CPA的浓度。由于扩散速度不如质量对流快，需要长而窄的通道尺寸才能实现通道中的完全扩散。微流体的方法可以满足这些要求。 在冷冻和解冻步骤之后，我们使用相同的微流体概念从解冻的细胞中卸载CPA（图1C）。 在这种情况下，我们从两个侧通道引入PBS溶液，并将解冻的细胞再次注入中间。 通过扩散，解冻细胞的CPA浓度逐渐降低，从而解决CPA卸载阶段的渗透性休克。

图1：本研究中介绍的细胞冷冻保存的示意图。 微流控方法由三个步骤组成：（A）CPA加载;（B）冷冻和解冻;（C）CPA卸载。采用微流控装置试图在冻存之前和解冻后逐渐改变细胞保护剂的浓度。在CPA加载步骤（A）中，细胞沿着微通道行进，从而经历CPA浓度的逐渐变化 这可以使细胞的渗透冲击最小化。在细胞冷冻和解冻步骤（B）中，我们遵循标准的冷冻保存方案。为了从解冻后的细胞中卸载CPA，将它们同时注入通过两侧通道的PBS缓冲液注入微流体通道（C）。

微米级渗透冲击的表征

细胞膜对于基质、流体、离子和气体等有不同的运输途径，依赖于不同的物理化学或生物学机制来帮助控制动物细胞的渗透平衡。[36,37] 与冷冻保存相关的细胞运输机理涉及水和渗透性溶质。[38,39] 在低温生物学中，运输通道行为由CPA浓度和CPA加载/卸载期间的变化率决定。特别是，了解CPA添加和去除速率如何影响细胞的渗透压休克和细胞活性很重要。通常，在大多数常规冷冻保存方案中采用一步加载/卸载，而对生殖细胞采用逐步加载/卸载。[24] 图2A示意性地表示本研究中使用的三种不同的加载/卸载分布。 虽然这三种配置具有不同的CPA浓度递增或递减率，但最终浓度是相同的（图2A）。我们利用扩散现象的微流控方法分别在加载和卸载步骤期间沿通道产生凹和凸的CPA浓度轮廓。为了研究不同分布对水和CPA运输的影响，并开发一种减小渗透压的更好的微流控方法，我们使用Kedem和Katchalsky（KK模型）提出的三参数模型。[40] KK模型是基于不可逆热力学推导的，由三个参数组成：水渗透力系数、反射系数和溶质渗透率。为了消除模型参数的影响（表格S1），我们通过尺寸分析定义了特征参数，以使模型系统无尺寸化。已知水通量控制细胞体积取决于细胞膜上水通道（水通道蛋白）的存在，并且其在确定

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