可用于乳酸脱氢酶开启荧光检测的电纺量子点/聚合物复合多孔纤维外文翻译资料

 2022-07-29 02:07

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可用于乳酸脱氢酶开启荧光检测的电纺量子点/聚合物复合多孔纤维

Xiaolong He，Longfei Tan，Xiaoli Wu，Chuanmiao Yan，Dong Chen，Xianwei Meng and Fangqiong Tang

2012年5月15号收到，2012年7月24号接受

DOI: 10.1039/c2jm33078d

摘要

我们通过静电纺丝制备了一种基于镉硒量子点/聚己内酯（PCL）复合多孔纤维的新型酶传感器。我们选择PCL，一种生物相容性聚合物作为电纺纤维的主体聚合物，并选择硒化镉量子点作为传感探针制备。实验结果表明，硒化镉量子点在PCL的N，N-二甲基甲酰胺、氯仿混合溶液中均匀分散并具有化学惰性。因此，硒化镉量子点均匀分布在PCL纤维上，使纤维保存了量子点原有的荧光性。此外，纤维的二级多孔结构由引入粒子，加速粒子在纤维内部的扩散产生的，这也增加了传感器的灵敏度。这种荧光纤维能与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）产生猝灭效应，这是由于NAD和硒化镉量子点之间的电子转移（ET）。基于这些纤维形成的薄膜和酶催化的反应将其简化形式的NADH的酶催化反应，该传感器成功地实现了乳酸脱氢酶（LDH）的荧光开关检测。每个样品的检测时间只有10分钟，并且从200–2400 U L-1得到LDH活性的线性校准曲线。这些量子点复合多孔纤维可作为一种简便、快速、灵敏、稳定的NAD依赖性酶的检测平台，并在光学器件上有潜在的应用。

引言

酶活性检测对于临床诊断各种人类疾病具有重要意义1-4。可催化L-乳酸和丙酮酸相互转化的乳酸脱氢酶（LDH）几乎存在于人体的所有器官中。如有一些生理疾病，如溶血性贫血，充血性心脏病和肝炎，特别是肝癌，这些组织细胞环境中的LDH水平将高于正常水平。因此，LDH活性检测在这些疾病的早期诊断和术后监测中具有重要意义5-7。已经开发了许多用于LDH活性分析的技术，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）和比色，荧光或电流检测8-10。在这些分析方法中，基于量子点（QDs）的荧光分析已经成为快速、灵敏地检测酶活性的有力技术，因为它们被尺寸控制的荧光，高荧光量子产率，宽吸收，窄发射光谱，和抗光漂白的稳定性11-14。 然而，在均相中基于量子点进行的感测由于其具有较差的再现性和低稳定性而受到限制，这是由于具有生物分子的量子点的复杂功能化以及在检测的溶液中量子点容易聚集15,16。因此，有必要开发一种用于制造简单，高度稳定和超灵敏的量子点的光学传感器的新策略。

现在，静电纺丝已经被认为是一种制造具有大表面积的纤维膜和三维多孔结构的通用和有效技术，用于快速和灵敏的传感应用17-20。通过引入感应探针或分子识别位点，电纺纳米纤维已被开发为各种荧光传感器，例如金属离子传感器，气体传感器和pH传感器21-25。最近，已经进行了将量子点集成到具有良好再现性、优异光化学稳定性和高灵敏度的新型光学传感器的电纺纤维中25,27。Li等人证明，电纺丝可以将合成的碲化镉量子点良好地分散在聚乙烯醇纳米纤维中，并且有效地避免了量子点之间的共振能量转移（FRET），从而导致原始荧光性质的良好保持的量子点28。Meng等人 合成了CdSe / ZnS核壳量子点/聚苯乙烯电纺纤维，对湿度敏感显示且具有快速响应、高灵敏度、优异的可逆性和长期稳定性29。然而，据我们所知，没有关于基于量子点复合电纺纤维的生物传感器的制备报告。

在这项工作，我们第一次报告基于量子点复合聚合物电纺纤维的新型酶传感器。 我们选择聚己内酯（PCL）作为静电纺丝纤维的主体聚合物，并准备硒化镉量子点作为该传感器的传感探针。由于溶剂通过静电纺丝的会快速蒸发，硒化镉量子点均匀地分布在PCL纤维中，并且电纺QDs / PCL纤维具有极亮的荧光。为了加速内部纤维分析物扩散的速度并增加其灵敏度，通过引入致孔剂来增加纤维的二次多孔结构。 此外，我们发现这些准备好的荧光纤维可以通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）并且由于NAD和CdSe QDs之间的电子转移（ET）过程可逆淬灭。 基于由这些纤维形成的膜和酶催化的反应以打破ET过程，该传感器已成功地实现NAD依赖性酶，乳酸脱氢酶（LDH）的荧光开启检测。与荧光猝灭传感器相比，该荧光开启酶传感器可有效降低背景信号，避免实际样品中其他猝灭剂引起的假信号干扰，最终提高传感器的灵敏度和选择性30-33。用于感测的量子点/聚合物复合荧光多孔电纺纤维的制造，可以被开发且用于分析多种简单的酶，为其提供快速，灵敏和稳定的平台。

实验

化学品与试剂

氧化镉（99.99%），硒（99.5%，100目），油酸（OA，90%），N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和氯仿均购自国药集团化学试剂北京公司；三辛基氧化膦（TOPO，90%），三辛基膦（TOP，97%），1-十八碳烯（ODE），油胺（OLA，70%），聚己内酯（PCL，Mw=800000），triton X-45（TX-45），L-乳酸（LL），尿酸（UA），beta;-D-葡萄糖和D-半乳糖（DG）均购自Sigma-Aldrich。乳酸脱氢酶（LDH，30 U mg-1），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购自上海凯生生物科技有限公司。含有由KH2PO4和Na2HPO4P（BS 0.2 M，pH = 7.0）组成的0.1 M KCl的磷酸盐缓冲液。 使用所有化学品不进一步纯化。

油溶性CdSe量子点的合成

CdSe量子点通过文献中描述的方法稍作修改可获得34。简言之，将0.1 mmol CdO，0.5 mL OA和15 mL ODE装入25mL三颈烧瓶中，在氮气流下加热至260 ℃约2小时，得到澄清溶液。之后，将混合物冷却至室温，并加入1 mL OLA和0.5 g TOPO。当混合物在氮气流下再加热至280 ℃以形成光学透明溶液时，将含有0.2 mmol Se，300 mu;L TOP和2 mL ODE的硒前体溶液迅速注入反应烧瓶中。 注射后，将温度降低至约260 ℃以生长量子点。 保持此温度约20分钟，获得CdSe量子点。

明显的紫外-可见吸收峰如图1所示。 如图1所示，CdSe量子点的第一激子峰出现在580 nm，其他吸收峰出现在400至550 nm。 第一激子峰的窄形状表明所制备的CdSe量子点是高度结晶的和单分散的35。荧光发射最大值出现在593 nm，半最大值的全宽约为38 nm（图1）。CdSe量子点的透射电子显微镜（TEM）图像如图2所示。这表明CdSe量子点具有窄的尺寸分布。 我们已经对TEM的CdSe量子点进行了统计尺寸分析，并根据我们基于CdSe量子点的明显的紫外-可见吸收峰计算的结果检查这个值36。我们发现这两个值几乎相同。 CdSe量子点的平均尺寸为3.8plusmn;0.1 nm。

合成CdSe量子点复合电纺丝荧光多孔纤维膜

CdSe量子点复合电纺丝荧光多孔纤维膜的制备如下进行：为了将CdSe量子点分散在电纺丝溶液中，我们必须将它们与反应混合物分离以除去过量的配体和反应前体。 通过向反应混合物中加入甲醇和氯仿沉淀所制备的CdSe量子点，并通过离心分离。最后，将CdSe量子点重新溶解在含有氯仿和DMF的溶剂混合物（氯仿：DMF = 6:1，体积比）中用于电纺丝。量子点的浓度为0.5 mM。 通过将PCL（15重量％）溶解在上述混合物中，然后剧烈搅拌来制备电纺溶液。 CdSe量子点与电纺溶剂中的PCL混溶。

图1. CdSe量子点的光学性质：CdSe量子点的明显的紫外-可见吸收峰和荧光发射

图2. CdSe量子点的典型TEM（透射电子显微镜）

为了制备二次多孔结构的纤维，将一定量的作为水溶性致孔剂的TX-45加入到所制备的电纺丝溶液中。由于TX-45在电纺丝溶液中的良好混溶性，相同的电纺参数对于加入或不加TX-45的溶液是有效的。使用注射泵将制备的溶液以0.5 mL / h的流速转移到注射器中。高压电源产生15 kV的直流电压，施加在注射器尖端和接地的集电器之间。工作距离为15 cm，针的内径为0.9 mm。随机将纤维收集在氧化铟锡（ITO）涂覆的玻璃板（0.8 cmtimes;2 cm）上，收集时间为6分钟。将获得的纤维膜浸入水中12小时以除去TX-45，然后在室温下的真空烘箱中干燥另外12小时以除去水37。最后，制造电纺丝荧光-多孔纤维膜。

仪器和表征

使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian，Inc.）进行荧光测量。 为了使用Hitachi S-4300扫描电子场发射显微镜（SEM）观察形态，用Au溅射纤维。 用在200 kV下操作的JEM-2100电子显微镜获得透射电子显微镜（TEM）图像。 使用JASCO V-570分光光度计在室温下记录UV-vis吸收光谱。 在Nikon-Ti（日本）荧光显微镜上拍摄荧光图像。

荧光实验

硒化镉量子点 / PCL电纺复合膜的荧光光谱在400 nm的固定激发波长下以300 nm / min的扫描速率记录。 激发和发射的缝隙宽度均为5 nm。 在550至680 nm的范围内记录荧光信号。 检测实验描述如下：为了研究NAD的淬灭效应，将固定在ITO玻璃片表面上的感测膜浸入2 ml具有不同浓度的NAD PBS缓冲液（pH = 7.0）中。 在某些时间记录感测膜的荧光强度。 LDH活性的检测程序如下实现。 在将一定量的NAD加入2 ml的PBS缓冲液（pH = 7.0）中后，将感测膜浸入混合物中5分钟。 然后，再加入等摩尔量的底物LL和不同量的LDH 5分钟。 最后，收集用于感测膜的发射数据。

结果与讨论

硒化镉量子点/ PCL复合电纺丝荧光多孔纤维膜的表征和性能

在这项工作中，我们选择PCL，一种生物相容性聚合物，作为静电纺丝纤维的主体聚合物。 此外，我们准备CdSe量子点作为这种传感器的感应探针，不需要任何过剩的功能。 在本研究中，我们发现CdSe量子点与含有N，N-二甲基甲酰胺和氯仿的静电纺丝溶剂混合物中的PCL混溶，特别是PCL对CdSe量子点化学惰性，如图1所示。 如图3所示，由PCL和QD / PCL制成的电纺纤维均显示均匀且平滑的形态，直径范围为约2 mu;m。 比较PCL和QD /PCL电纺纤维，形态和直径没有表现出明显的差异，表明添加CdSe量子点不会影响纤维的原始形态。

使用TEM观察CdSe量子点在纤维中的分布（图4）。 CdSe量子点均匀分布在PCL纤维中。 通常，溶液共混方法通常在溶剂蒸发时引起相分离，并且纳米颗粒将聚集，但是在这里CdSe量子点在PCL电纺纤维中获得与溶液中的分布一样的分布。这是因为在电纺丝过程中溶剂的快速蒸发速率导致PCL聚合物链的快速“冷冻”，并且CdSe量子点被限制在它们的位置，没有时间聚集，导致保存了量子点良好的原始荧光性能。因此，通过静电纺丝制备极亮的量子点 / PCL纤维。 还在图1中研究了量子点/ PCL荧光多孔纤维膜的荧光性质。 与CdSe量子点相比，所得纤维的发射峰稍微改变，这也表明纤维中量子点的分离地非常好，并且量子点的原始荧光性质得以保持。

通过引入致孔剂（TX-45）来增加该传感器的灵敏度从而来制造纤维的第二多孔结构。 在静电纺丝之前，将一定量的TX-45加入到含有PCL和CdSe量子点的电纺溶液中。 TX-45是水溶性的，因此通过将膜浸入水中12小时37，可以从制备的纤维膜中完全溶解。使用SEM观察纤维表面的形态。 没有TX-45的PCL纤维的表面是平滑的（图6a）。 通过将致孔剂浸入水中除去致孔剂后，在含有TX-45的纤维内形成均匀的孔，得到多孔纤维（图6b）。

最近的论文报道，电子转移（ET）过程可以发生在NAD和NAD官能化的亲水性核壳CdSe / ZnSe量子点之间，并且量子点的荧光将被淬灭38,39。在我们的研究中，我们发现我们制备的CdSe量子点复合荧光多孔纤维可以通过溶液中的NAD分子直接进行可逆地淬灭。 在我们的系统（方案1）中，NAD分子扩散到掺杂在多孔纤维中的CdSe量子点的表面并影响量子点的表面化学键。 NAD作为良好的电子受体（蓝色部分）立即捕获由光激发的CdSe 量子点的电子，并且发生量子点和NAD之间的ET过程。 因此，电纺丝荧光多孔纤维膜的荧光被淬灭。

图3.（a）和（b）PCL纤维的电纺纤维的SEM图像；（c）和（d）量子点/ PCL纤维

图4. QDs / PCL的电纺纤维的TEM图像。

图5. PCL纤维，QDs和QDs / PCL纤维的归一化荧光光谱

图6.（a）PCL纤维和（b）TX-45与PCL的比例为1:2的多孔纤维的SEM图像

方案1. 基于CdSe QDs掺杂的荧光多孔纤维和酶催化反应的LDH活性的测定原理。（a）开启检测过程示意图；（b）膜的荧光照片；（c）NAD和NADH的结构式

图7. 荧光多孔纤维（TX-45与PCL的比例为1:2）（a）在浸入NAD（10 mM）PBS缓冲液中之前和（b）之后10分钟的荧光图像

通过荧光显微镜观察荧光多孔纤维膜对NAD（10 mM）PBS溶液的淬灭效应（图7）。 在量子点 / PCL复合膜

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