环金属铂(II)配合物作为高灵敏度发光开关探针在蛋白质染色中的实际应用 以及细胞成像外文翻译资料

 2022-08-15 02:08

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DOI：10.1002/chem。 200802707

环金属铂(II)配合物作为高灵敏度发光开关探针在蛋白质染色中的实际应用 以及细胞成像

彭武，黄丽明，马代龙，汤秀明，吴关明，车志明* [a]

发光过渡金属配合物对光化学越来越感兴趣，[1] 有机光电子，[1,2] 以及发光传感器。[1,3,4] 目前，用于蛋白质染色的发光金属配合物的数量非常少。 一个值得注意的例子是一种发光钌络合物， 作为一种配方溶液出售， 称为SYPRORuby染料，它表现出高灵敏度，与肽质量指纹分析完全兼容，以及蛋白质染色的广泛动态范围。[5] 这种荧光染料的结构仍未公开，阻碍了协议的充分控制及其在各种实验条件下的优化。 最近，一种基于八面体铱(III)复合物的选择性发光开关探针用于组氨酸/组氨酸丰富蛋白的染色。[6] 铱复合物与组氨酸/组氨酸丰富蛋白的共价结合使这种发光铱(III)探针难以与下游蛋白质组学技 术如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱相结合。

与八面体铱(III)和钌(II)配合物相比，方形平面铂(II)配合物具有更多的金属离子暴露在溶剂环境中，并且表现出更容易受到局部环境微妙变化的光物理和发射特性。 在文献中，结构扭曲3 铂(II)配合物的MLCT（三重态金属-配体变化转移） 激发态

[a]P.Wu，E.L.-M.Wong博士，D.-L.Ma博士，G.S.-M.Tong

博士，K.-M.Ng博士，C.-M.Che教授化学系和

药物发现与合成分子技术研究所化学生物学开放实验室

香港大学

香港薄扶林道（中华人民共和国)传真：

(85 ）22857-1586

电子邮件： cmche@hku.hk

本文的支持信息可在下面的WWW上获得

http://dx.doi.org/10.1002/chem.200802707.

使这种激发态的发射对局部环境高度敏感。[7] 在以前的工作中，我们和其他人已经证明，铂(II)配合物在溶液中的发射特性的显著变化可以通过生物分子的存在来诱导..[4,8,9] 配合物[Pt(Thpy)-(Hthpy)Cl]的进一步研究 (Hthpy=2-(2lsquo;-thienyl)吡啶)，是一种de

在我们的前期工作中报道的铂(II)配合物的研究， [4e] 结果表明，由于以下原因，该复合物不能在不干扰PEPTidemass指纹分析和活细胞成像的情况下应用于非特异性蛋白质染色：I) 检测限差(=3mg至HSA)，II)高毒性(IC)50 值1mm)，III)特异性高

对HSA（蛋白质检测灵敏度受蛋白质变化的影响），IV)与蛋白质共价结合（未发表的结果）。

在本工作中， 我们制备了[Pt(C^N^N)Cl] 配合物1-3 （ 图1），其中含有修饰的6lsquo;-苯基-2，2rsquo;-联吡啶配体，发现这些配合物具有以下性质：I)3 可见光谱区的MLCT发射（磷光的长发射寿命可以提高图像信号的稳定性，减少荧光产生的背景噪声），ii)在水中的溶解度和稳定性.

室温染色溶液（因此，使用有机溶剂不是蛋白质的最佳传感所必需的），和III)通过非共价相互作用与蛋白质结合。 通过使用这些配合物，我们成功地证明了发光铂(II)配合物在蛋白质染色和活细胞成像中的实际应用。 常用的分光光度法，如布拉德福德， [10a] BCA， [10b] 洛里检测， [10c] 用于蛋白质定量，通常受到样品制备缓冲液中干扰剂的阻碍，需要较大的样品体积，动态范围有限，并表现出受蛋白质结构、氨基酸序列和等电点(PI)影响的响应。 从而发展.

3652 copy;2009年Wiley-VCHVerlag有限公司 凯加A，温海姆 化学。欧元。j.2009,15,3652–

3656

图1. 配合物1-5的化学结构。

在生物化学中，检测灵敏度高、结合线性度好、蛋白质对蛋白质变异小、样品消耗低的蛋白质的分析工具具有特别重要的意义。

支持信息描述了1-3的合成和表征，以及相关的铂(II)配合物4和5^N^C、N和N^N配体。 紫外-可见吸收光谱和核磁共振波谱显示，这些铂(II)配合物在室温下在水溶液中稳定72h。最重要的a 确定1-5中COOH组的值为 6.8–

通过酸碱滴定曲线6.9，表明这些COM丛含有去质子化羧酸盐。 在支持InforMation中，表S1列出了1-5的光藻数据。 激发1a(60 毫米在H2在l=410nm处的O)在563nm处有微弱的发射，这是由于3 MLCT激发态。[7] 配合物1b有其发射l 马克斯522nm，而2和3表现出弱发射，与l 马克斯

在DMSO/H中的656nm处2 在H中O和631nm2 哦，分别。 由

于萘基的p-共轭扩展，2的656nm发射被指定为具有a3 白细胞介素（内）特征。 其中3的631nm发射暂定为.

签名给3 虽然与IL混合，但IL电荷转移激发态3 不能排除MLCT 激发态..

在lgt;380nm激发下，5有其发射 l 马克斯 在H中545nm处2 而4 则具有较强的发射能力

l 马克斯 在507nm处(f=0.44，t=9.1ms)3 。 由于4在H中溶解度差2 在CHCl中测量了4的光物理数据3.

磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中1a（ 60 毫米） 的溶液是弱发射的，如图2所示。 在溶液中加入牛血清白蛋白(BSA)可使其发射强度提高26倍 l 马克斯当[BSA]/[1a]的浓度比从0增加到1.0 时，=531nm。 将添加剂从BSA改为

图2. 在20.08C时，随着[BSA]/[Pt]比（从0到1.0）的增加，PBS缓冲液中1a

（60毫米）的发射光谱痕迹；b)在没有BSA和存在BSA的情况下，PBS缓冲液中1a的照片。

甘氨酸、苯丙氨酸或色氨酸不会导致发射增强，即使氨基酸的摩尔比为10：1。 当1a在531nm处的发射强度与BSA浓度成正比时，校准图显示出良好的线性关系(R-值gt;0.998)

BSA浓度范围为1-1000mgML—1 得到了

(支持资料图S1)。 相反，具有N^C^N配体的强发射铂(II)配合物4不如[Pt(C^N)Cl]配合物4，即使在没有蛋白质的情况下的情况下也是强发射的，导致高背景水平。

对于大多数蛋白质检测方法，以BSA或免疫球蛋白G(IgG)为标准，创建校准图。 在本工作中，检测了1a在人IgG、人血清白蛋白(HSA)、转铁蛋白或卵清蛋白以及BSA存在下的发射。配合物1a在相同浓度下检测的所有五种蛋白质的发射光谱变化几乎相同。 数据给出在支持信息部分，图

C.-M.Che等人

乌尔S1。 与蛋白质检测试剂(如商用考马斯亮蓝(CBB)和WST- 1)的比色类型所显示的明显蛋白质对蛋白质的变化相反，[11] 改变蛋白质对1a蛋白的检测灵敏度不受影响，因为对相同浓度的蛋白质(BSA、人IgG、HSA、转铁蛋白或卵清蛋白)的反应相同。 这揭示了仅使用一个校准图来监测蛋白质浓度的潜力，这在蛋白质的检测中至关重要。[12]

1a对各种非蛋白物质的反应，

如无机盐（氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、氯化钴、氯化锌、氯化钙)和洗涤剂(十二烷基硫酸钠） 还对Triton X-100进行了检查。 所有的测试都是在60毫米的浓度下形成的 在过量的外来物质存在下，BSA与60毫米的1a混合。 发射强度变化小于5%.

在添加外来物质时观察到Ty。 这些结果反映了一个总体趋势，即1a对BSA的反应不受非蛋白物质的存在的影响。

我们能够检查BSA在十二烷基硫酸钠-聚酰胺凝胶中的染色1a，这是由于固相蛋白质测定或凝胶电泳提供的有益保护作用，以避免干扰物质。[13] 图3显示了包含elec的发射凝胶图像

图3 以1a为检测染色剂的BSA SDS-PAGE分析。 浓度1a为0.6mg/20mL.. 静置时间为30 5min.. 兰A-K分别对应于300、250、200、150、100、50、30、20、10、8和6ng的BSA量。 莱恩S是一种蛋白质标记的混合物，每个带约4毫克蛋白质。

营养BSA(6-300ng ， 每车道总蛋白) 染色后0.6mg/20ML ， 1a30min 。 最低检测到的BSA 量为每条带6.0ng( 图3 中的LaneK)，检测限低于3次发现的20ng(支持信息中的图S2)和4- 5次发现的3mg。 也用de检测到HSA.

在相同的条件下，用1a染色，检测限为6ng

条件=。 在许多情况下，1a在蛋白质染色中的敏感性与银染法相当。[14] 此外，=1a不干扰酶（胰蛋白酶）消化，染色与肽兼容

质量指纹分析，如支持信息表S2所示。

与使用蛋白质染色的常规方法(如胶体金/银、考马斯蓝、PonceauS、邻苯三酚红钼酸盐和双金属螯合剂(DMC))相比， 1a染色过程迅速、简单。[13c， d， 14-16] 例如，不像最常用和商业上可用的CBB[14] 染色需要很长（一夜）的染色时间来改善带对比，1a的染色不需要去染色

步骤(当24小时时没有发现信号强度的增加

命运被执行)。

由于1a在水溶液中是可溶的和稳定的，因此不需要使用 有机溶剂对具有1a的蛋白质进行最佳染色.. 注意，对于使用SYPRO Ruby染料的方法，[5] 染色液必须含有7%

醋酸。[17]

对于蛋白质的1a染色，包括BSA和HSA，发现了一个线性动态范围(R-值=0.99)，范围从1到1000ng。 这种扩展的线性响应在使用2D凝胶和肽质量指纹(PMF)的蛋白质分析中具有重要意义。 我们将我们的分析扩展到包括六种不同的蛋白质用于蛋白质标记(磷酸化酶b、BSA、卵清蛋白、碳酸酐酶、大豆胰蛋白酶抑制剂和溶菌酶)， 并发现1-3可以非特异性地染色蛋白质标记（图4），表明磷光铂(II)复合物的蛋白质染色可能是一种普遍现象 (支持信息中的图S3)。

图 4. 以 1a 为 检 测 染 色 剂 的 市 售 蛋 白 标 记 的 SDS-PAGE 分 析 。[1a]0.6mg/20m L(染色时间=30 = t 5分钟)。 兰A-H分别对应于48、24、12、6、3、1.5、0.75、0.38mg的蛋白质标记量。

为了检验实际应用，采用1a染色法对一种复杂的蛋白质混合物进行二维SDS 聚酰胺凝胶电泳(PAGE) 。 根据Amersham生物科学提供的手册提取HeLa细胞（人颈上皮 样癌） 的全细胞裂解物。 用1a(0.6mg/20mL) 染色30min 后，在二维SDS-PAGE上可分辨出约0.5mg的提取蛋白混合 物（图5）。 在相同条件下，SYPRORuby获得了类似的染色模式

图5. 以1a为检测染色剂的蛋白质的发射2D SDS-PAGE分析。

问题(支持信息中的图S4)。 我们还证明了1a作为检测聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上蛋白质的染色试剂的可行性。对含0.01~1.28mg HSA的溶液进行Westernblot分析

随后染色1a(0.6mg/20mL)30min

在支持信息中的图S5中给出。 这些结果表明，1a可以应用于蛋白质的检测，通过Westernblot分析。

我们进一步扩展了1a在染色完整细胞蛋白方面的应用。将HeLa细胞与1a(60mm)孵育12h。 用标准程序提取的细胞总蛋白用 sdspage。 一系列蛋白质混合物的发射图像，其总量在100~300mg之间，可以被分辨出来，表明1a被细胞和细胞PRO吸收

茶素随后被染色(支持信息中的图S6)。 电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对1a处理的HeLa细胞Pt含量的分析表明，1a有效地进入癌细胞，细胞摄取水平与时间有关(支持信息中的图S7)。 重要的是，IC50 对HeLa细胞的1a值为80mm，这表明这一点

复合物相对不具有细胞毒性。 因此，我们检查了

1a作为活细胞成像发光探针=的应用。 孵化后 在5%CO的气

氛下，HeLa细胞在37°C时为1a(5mm)2 95%的空气持续24小时， a

观察到发光的明显增强（图6，左）。 还记录了HeLa细胞与

1a孵育后的亮场图像（图6，中间）。 的.

图6. 发光（左)，亮场(中)，覆盖(右）图像的HeLa细胞与1a（5毫米）在

378C孵育24小时。

发光和亮场图像的叠加（图6，右）表明，不同强度的发光信号定位在HeLa细胞的不同隔间。 值得注意的是，Pt复合物主要分布在细胞质内，核摄取水平较低（见图6）。 复合物在核周区的较高定位程度表明1a与疏水细胞器如内质网和高尔基体相互作用.. 所有这些数据表明，1a可以发展成为一个发光开启探针的生物成像。

为了阐明1a与蛋白质结合时发射增强的机理， 我们对[Pt(C^N^N)Cl](1alsquo;，C^N^N)和[Pt(Thbipy)Cl](3alsquo;，thbipy=6rsquo;- 2rsquo;-联吡啶)进行了密度泛函理论(D FT)计算。 如图所示

图7，在1alsquo;和3rsquo;的单态激发态中，the

铂原子与辅助C^N^N或Thbipy配体共面。 然而，最低的三重态激发态1alsquo;是

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