真正的荧光激发依赖性碳点及其在多色细胞成像和多维传感中的应用外文翻译资料

 2022-08-15 03:08

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标题：真正的荧光激发依赖性碳点及其在多色细胞成像和多维传感中的应用

正文：

碳点（CDs）是碳基荧光（FL）纳米材料中最重要的一类，近年来受到了广泛的关注。由于其优异的光学性能(例如高光稳定性、双光性和荧光激发依赖性），良好的生物相容性和易于制备的特性，CDs已展示出许多潜在的应用，如传感、生物医学、催化和光电子器件。在CDs优异的光学特性中，发射依赖于激发的光学性能非常有趣，但遗憾的是，这种独特的光谱特性的应用仍然很少被开发。这可能是由于以下两个原因:i)虽然许多报告都介绍了激发依赖性CDs，但其荧光发射波长的变化往往伴随着强度的强烈降低，而这种光学性质不能真正被称为激发依赖性；ii)理解和设计CDs的荧光激发相关发射非常具有挑战性，因此，很难根据需要合理设计CDs。鉴于CDs通常由多个发射中心组成，这些发射中心被认为是其依赖于激发的荧光发射的原因。我们感兴趣的是寻找一种方法来获得真正依赖于激发CDs，它可以被宽带光激发，但不影响峰值发射强度。然后，我们希望通过分析其他真正依赖于激发的CDs的化学成分/结构与荧光发射之间的关系，获得一些对指导合成有意义的知识，并为将来的应用奠定了基础。

在这篇通讯中，我们首次报道成功制备了真正的荧光激发依赖性碳点(也称为全色CDs，简称F-CDs)，这种CDs在改变激发波长时，几乎在整个可见光谱中都表现出了异常相似的发射强度。随后，确认了F-CDs由多个发射中心组成，并详细讨论了它们的组成与荧光发射之间的关系。此外，细胞毒性和成像测试表明，F-CDs可以作为一种多色生物标记试剂。最后，利用F-CDs构建多维传感平台，实现对多种金属离子的同时检测和识别。这项初步研究显示了真正全色CDs在多模式传感中的潜力。

F-CDs可以通过在高压釜中于160°C微波加热柠檬酸甲酰胺溶液1小时，然后进行透析纯化来轻松制备（图1a，实验部分详见支持信息）。注意，此处使用甲酰胺是成功制备该材料的关键因素。然后，用透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）进行表征以证明成功获得CDs。如图S1a,b支持信息所示，F-CDs显示出均匀的纳米颗粒，平均尺寸约为6.8nm。此外，高分辨率透射电镜(TEM)检查显示，由于几乎没有观察到晶格条纹，因此大多数F-CDs为非晶态结构(图S1c，支持信息)。AFM图像显示它们是单分散的，粒子高度相似，约为3nm(图S1d，支持信息)。从AFM观察到的尺寸小于TEM观察到的尺寸，说明这些CDs在AFM测试的样品制备过程中发生了坍塌，这与之前的报道类似。

随后，对F-CDs的光学性质进行了深入的研究。与以前的报告不同，即CDs的发射强度随激发波长的变化而显着降低，当激发波长从330nm改变到600nm时，F-CDs显示出不同寻常的可比较的发射强度，而相应的发射几乎覆盖了整个可见光谱(图1b)。此外，这种全色发射现象也很容易被肉眼观察到(图1d)。从图1b可以看出，在相对高能量的光下，F-CDs的荧光光谱显示出宽的或包含多个发射最大值激发（例如330-480nm），证明了所产生的发射可能进一步（部分）充当激发光，并因此引起多重发射。同样，F-CDs还显示出异常宽的紫外-可见吸收带（尤其是在可见光区域，图1c），表明存在多个电子吸收跃迁。通过更加仔细的观察，可以从F-CDs的荧光光谱中发现几个最大发射值，其中有三种主要的最大发射值是asymp;466，asymp;555，asymp;637nm(图1b)。为了验证三种发射的不同特性，测量了它们的荧光激发(FLE)光谱，发现彼此之间存在显著差异，表明它们来源于不同的发射状态(图S2a，支持信息)。此外，这三种发射的荧光寿命进一步证实了它们的不同性质。如图S3和表S1（支持信息）所示，在319、457和588nm激光激发下，三种发射的平均寿命分别为3.20、0.87和0.68ns。最后，在360、450和540nm的激发下，F-CDs的量子产率（QYs）分别为11.9%、16.7%和26.2%（表S2，支持信息），证明它们在相当宽的激发波长范围内具有可观的荧光发射效率。

图1：a)制备全色发射CDs的示意图。 b）在不同激发波长下，F-CDs的荧光光谱。c）F-CDs的紫外-可见吸收光谱。d）F-CDs的荧光发射照片以30nm为增量以330nm记录到600nm。所有光谱和照片均在去离子的H2O中获得。

为了更清楚地说明F-CDs的多色发射性质，进行了单粒子荧光成像实验（请参见实验详细信息，支持信息）。如图2a-c所示，在不同的波长激发下波长(即365、475和535nm)，观察到了几乎相同的荧光发射图像。当这些数字重叠时，大多数发射点被发现重叠良好（图2d）。这些发现不仅直接证实了F-CDs的多色发射是由单个颗粒而不是具有不同荧光的混合物引起的，而代表了利用单粒子荧光成像技术观察碳点多色发射的第一个实例。

图2激发条件下F-CDs的单粒子荧光发射图像 a) 36nm，b）475nm，c）535nm和d）它们的重叠图像。

为了更好地理解和揭示F-CDs不同寻常的荧光特性的起源，采用了相同的方法，但温度较低，反应时间较短，制备了另一种材料(见实验部分，支持信息)，该材料主要在蓝光区域显示强烈的发射 （命名为B-PL材料；图S4，支持信息）。请注意，TEM或AFM均无法检测到B-PL材料的纳米颗粒，这表明其分子/聚合物的性质类似于先前报道的情况。对比F-CDs和B-PL材料的紫外-可见吸收(图S5，支持信息)，有趣的是，它们在紫外区域(asymp;240-400nm)非常相似;而F-CDs在可见光区(asymp;400-750nm)则表现出更强的吸收带。这种显著的差异清楚地表明，F-CDs在可见光区域的电子吸收跃迁应是它们的长波长发射（从绿光到红光区域）的原因。接下来，对F-CDs和B-PL材料进行傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和x射线光电子能谱(XPS)分析来表征这些材料上的化学键和官能团，我们希望从中进一步阐明F-CDs的成分与荧光来源之间的关系。

如图3 a所示，F-CDs的FT-IR吸收峰在asymp;1650、asymp;1600和asymp;1340cmminus;1处(分别归因于C=N/C=O、C=C和C-N的拉伸振动)比B-PL材料的FT-IR吸收峰更强，同时在1720和1198 cmminus;1处峰强度显著降低(分别归因于羧基和C-O中的羰基)。这些观察结果表明，当B-PL材料被转换成F-CDs时，会发生进一步的脱羧反应，并形成更多的C=N/C=O、C=C和C-N键。这一推测可以通过XPS分析得到进一步验证(图3 b-e)。例如，图3b表明，F-CDs和B-PL材料主要包含相同的元素成分(即C, O和 N)，但前者的O含量比率较低（即B-PL材料和F-CDs的C：O：N=1.0：0.48：0.11和1.0：0.36：0.09（摩尔比））;图3 c、d为两种材料的高分辨率C1s XPS谱图，从图中可以看到，B-PL材料与F-CDs相比，羧基和C-O键明显减少，而C=N/C=O、C=C、C-N键增加;图3e总结了图3c,d的相应拟合结果，其提供了F-CDs和B-PL材料上官能团的进一步相对定量的变化。这些结果与上述定性分析非常一致。根据这些讨论，可以初步提出F-CDs的形成和全色发射如下。首先，柠檬酸和甲酰胺（或其分解产物或柠檬酸本身）经历脱羧和/或酰胺化反应，并产生分子/聚合物状的PL材料（即B-PL材料）。注意由于所施加的相对较低的温度和较短的反应时间，在此阶段没有形成纳米颗粒。该材料含有丰富的羧基和C-C/C=C键，但只有少量的C=N/C=O和C-N键组成(图3d,e)。紫外-可见观察很好地支持了B-PL材料中这类键的存在，即asymp;280和asymp;347nm处的峰归因于芳族pi;体系的典型吸收和宽而弱的吸收带（即asymp;400-500nm）是由于C=N/C=O和/或C-N的n-pi;*跃迁（图S5，支持信息，红线）。其次，在高温和长时间反应条件下，进一步发生脱羧、碳化、氮元素掺杂，导致C=C、C=N/C=O、C-N键增多，最终形成F-CDs。F-CDs在可见光区域观察到比B-PL材料更强的紫外-可见吸收带，再次得到它们较高C=N/C=O和C-N键含量的支持（图3c，e），进一步证实了F-CDs在可见光区域宽吸收带的起源。值得注意的是，F-CDs的紫外-可见吸收带也被发现要比B-PL材料(asymp;400-500nm)的波长区域(asymp;400-750nm)长得多，这意味着F-CDs中含有共轭结构的C=N/C=O和/或C-N键更大。总而言之，F-CDs的蓝光发射应来自芳香结构，而长波长（绿光至红光）发射是由于存在C=N/C=O和C-N键相关的官能团/结构。此外，作为一种具有实用价值的材料，制备的重复性是关键要求之一。因此，制备了三批F-CDs，并对其形貌(TEM)、光学性能(FL和UV-vis)、化学成分(FT-IR和XPS)进行了全面的检测。从图S6-S10(支持信息)可以看出，这三批F-CDs的观察到的性能非常接近，表明制备的重现性很高。

图3. a）F-CDs和B-PL材料的FT-IR光谱。b）XPS测量，c）F-CDs的高分辨率C1S XPS光谱，以及d）B-PL材料。 e) F-CDs和B-PL材料上不同官能团的相对含量（基于图3c，d的拟合结果）。

F-CDs具有独特的全色PL发光特性和良好的生物相容性，可作为一种潜在的多色生物标记试剂。为了证明这种应用，初步检验了细胞毒性和成像试验。通过MCF-7细胞的标准MTT试验来评估F-CDs的细胞毒性。如图S11（支持信息）所示，将MCF-7细胞与F-CDs在10至50micro;g mL-1的浓度范围内孵育24小时后，观察到细胞活力超过85％，证实了这种材料的低毒性。然后，评估F-CDs对活细胞和固定细胞的细胞成像能力。将MCF-7活细胞和固定细胞分别与F-CDs一起孵育后，分别用共聚焦显微镜在405、488和543nm的激发光下对它们成像。共聚焦显微照片在MCF-7细胞中显示出不同的发射颜色（图4a），表明F-CDs可能通过内吞作用（活细胞）或扩散（固定细胞）过程用于生物标记。值得一提的是，这些发射物几乎位于整个细胞区域，这表明F-CDs不仅可以穿过细胞膜，甚至可以进入细胞核。更有趣的是，还发现F-CDs具有上转换发射特性（图S12，支持信息），这将有助于它们在深组织成像中的进一步应用。

全色CDs的另一个吸引人的应用可能是在多双峰传感领域。在此基础上，研制了基于F-CDs的多维传感平台。多维分析方法在准确性、多样性和同时检测和鉴别多种分析物的能力方面具有优势。传统上，构建多维传感系统的策略主要包括传感器阵列，智能芯片和分子实验室/纳米粒子方法。这些努力在开发多维传感系统方面取得了很大的进展，然而，它们要么需要复杂的合成/制造过程，要么需要各种技术(或仪器)来获取信号，从而限制了它们的广泛应用。因此，多维传感系统的设计仍需要新的设计策略。有趣的是，发现F-CDs的发射被多种金属离子猝灭，但在360、450和540nm的激发下，它们的三种主要发射最大值的效率不同（即分别为466、555和637nm）。由于F-CDs的三个发射最大值的不同性质，这一发现很容易理解。因此，基于“纳米粒子实验室”方法制造了多维（三通道）传感平台，用于通过监测金属离子对F-CDs的三个发射最大值的猝灭效率来同时检测和区分各种金属离子，只需调整激发波长即可。这种多维传感装置设计的最大优点是能够最大程度地简化制造过程。为了说明该传感平台的性能，包括过渡、重和稀土金属离子(即以Fe2 、Fe3 、Co2 、Ni2 、Cu2 、Zn2 、Cd2 、Hg2 、Pb2 、Ag 、Cr3 、Ce3 、Eu3 共13个)为例。如图4b所示，基于13种金属离子对F-CDs(均在100times;10minus;6 M处)的三个发射最大值（即466、555和637nm）的猝灭，它们表现出明显不同的响应模式（分别在360、450和540nm激发下）。为了为这种区分提供更清晰的证据，这些三通道猝灭反应(表S3，支持信息)进行了主成分分析(PCA)。如图4c所示，所有这些金属离子被准确地分离出来，没有错误或分类错误。这些结果清楚地表明，F-CDs可以作为一个多模态光学传感平台，用于检测和识别多种金属离子。

图4. a）MCF-7细胞中F-CDs的共聚焦荧光图像；i–v）活MCF-7细胞，vi–x）分别在405、488和543nm激光激发，对MCF-7细胞进行荧光增强和融合处理。b）F-CDs在其三个发射最大值（即分别在360、450和540nm激发下分别为466、555和637nm）在HEPES缓冲液（10times;10-3M，pH 8.2）中对13种金属离子的FL响应（均在100times;10-6 M）。c）基于对F-CDs的三通道响应来区分13种金属离子（100times;10-6M）的PCA图

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