全氟酸扰乱细胞内Ca2 稳态的毒理学机制
Konrad Kleszczyński, Andrzej C. Składanowski *
Department of Molecular Enzymology, Intercollegiate Faculty of Biotechnology, Medical University of Gdańsk, ul. Dębinki 1, 80-211 Gdańsk, Poland
摘要：众所周知，全氟酸（PFAs）在全球的工业生产和生活中均有分布，它们增加了环境事件的出现和生物体的生物放大作用，引起越来越多的关注并描述其在生物体内和体外的作用机制。我们之前的调查广泛地描述了PFAs引起的细胞毒性中离子体膜电位去极化、酸化或线粒体功能紊乱下对碳链的氟化反应的影响。在这项研究中,我们提出了剂量和时间依赖下， PFA HCT116细胞内钙稳态的影响。对胞质钙离子浓度（[Ca2 ]c）和线粒体钙离子浓度（[Ca2 ]m）进行比较，流式细胞仪显示不同的钙吸收进入线粒体与PFAs的亲油性增加相关。事实上， 培养在400mu;M PFDoDA 4小时和72小时后，[Ca2 ]c被观察到分别减少29.83%和49.17%。同时，[Ca2 ]m增加2 - 4倍以上。暴露在非氟化癸酸(DA)中没有造成任何钙稳态的变化。所得数据显示，PFAs扰动钙分布似乎是一个环节的缺失导致线粒体功能障碍从而影响着细胞凋亡，包括PFAs的细胞毒性作用机制。
关键词：全氟辛酸、钙稳态、线粒体、细胞凋亡、细胞信号传导、HCT116细胞。
引言
全氟酸及其衍生物在许多工业生产中被用了约50年，多年来被认为是有化学毒性和生物毒性(Sargent and Seffl,1970)。最新报告描述PFAs显示出多样性包括影响过氧化物酶体增殖，肝肿大，增生，肝癌(Sohlenius et al.1993,1994)以及肝细胞增殖(Vanden Heuvel,1999)。同时也证明，各种链长PFAs可改变细胞间缝隙连接通讯(GJIC)(Upham et al.,1998)。一些观察到的影响可能是由于等离子体膜电位去极化(Kleszczyński Składanowski,2009)。广泛的结构特异性研究表明，毒性和线粒体解偶联活动依赖链长度，如C10-C14具有最大效应(Kleszczyński et al., 2007,2009)。同时，我们也证明，这些化合物启动信号通路导致氧化DNA损伤和细胞凋亡 (Kleszczyński et al., 2009)。细胞死亡的执行需要协调细胞内质膜间的信号(Bano et al., 2010)。起始信号可以在生成等离子体膜(Arudine Tymianski,2003)或由于细胞内压力(Green,2004; Szegezdi et al., 2006)产生。我们假设PFAs对细胞内钙稳态的扰动是由调解一个质膜和线粒体之间的信号来决定，那么细胞内钙离子浓度的变化应对不管是来自内部还是外部的各种各样的信号。一个大胞质[Ca2 ]c启动自我破坏的途径包括激活分解酶，产生自由基以及细胞内细胞器的功能重组。许多现在的报道称细胞内钙离子稳态变化与线粒体诱导细胞凋亡确实相关(Parone et al., 2002；Pinton et al., 2001；Mogen,et al., 2000)。线粒体钙离子积累的研究从1960年就开始了，但直到现在它们与细胞生理学和病理生理学有关的功能意义才变得清晰(Bill,1998；Duchen,1998；Krieger Duchen,2002)。线粒体基质中钙离子[Ca2 ]m的增加使得线粒体过渡孔(MPT) 打开，导致线粒体肿胀，线粒体外膜破裂，释放凋亡因素(细胞色素c、细胞凋亡诱导因子、caspase-9 Smac )以及酶G(Martinou et al., 2000; Parrish et al., 2001)。在这里，我们研究了线粒体钙离子通量的变化当HCT116细胞暴露在PFAs中。这项工作，与前两次的等离子体膜电位下降和细胞质酸化说明线粒体膜功能障碍的分子机制在细胞内(Kleszczyński Składanowski,2009)。
材料和方法
化学品和试剂
全氟化（脂族）酸（表1）：
表1：检查全氟酸的结构
全氟（PFHxA），全氟辛酸（PFOA）和全氟癸（PFDA）购自ABCR GmbH卡尔斯鲁厄，德国）。全氟辛酸（PFDoDA）由阿法埃莎公司（德国卡尔斯鲁厄）提供。非氟化癸酸（DA），购自Sigma（圣路易斯，密苏里州，美国）。储备溶液（10mM）中，以1％将化合物溶于二甲亚砜（DMSO）的水溶液中。 DMSO（Sigma公司，美国）工作液的最高浓度（0.08％）已证明是中性细胞。贝科氏改进的Eagle高糖培养基（DMEM）（4500毫克/升），1％青霉素 - 链霉素溶液（10,000单位的青霉素溶于1ml 0.9％NaCl），丙酮10mg链霉素，二甲基亚砜，甲醇，多聚甲醛，和胰蛋白酶-EDTA溶液（10times;）购自Sigma（圣路易斯，密苏里州，美国）。胎牛血清（Gibco公司细胞培养）由Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）提供。在钙稳态扰动检测中使用荧光染料，即荧光 - 4 / AM（CAS编号：273221-67-3）（西格玛，圣路易斯，MO，USA），用于细胞内钙水平的[Ca 2 ] c和RHOD-2 / AM（CAS编号：129787-64-0）（亚历克西斯Biomedicals公司，圣地亚哥,CA,USA）钙在线粒体基质中钙离子浓度M期。荧光 - 4 /AM和RHOD-2 / AM溶于DMSO，分别得到1mM的和890mu;m的储备溶液。 BAPTA / AM（CAS编号：126150-97-8）购自Sigma（圣路易斯，密苏里州，美国）。
细胞培养
HCT116细胞来源于贝尔特·福格尔斯泰因博士（约翰霍普金斯大学，美国）存储在BioMoBiL细胞库。该细胞培养在75cm 2的细胞培养瓶中DMEM含有10％[V/V]，37℃下灭活的5％胎牛血清和1％青霉素 - 链霉素溶液，在细胞对数生长期中进行细胞处理。
细胞处理
在实验中，将细胞接种在6孔板，密度0.3-0.4times;10 6个细胞/ cm2在培养基中和此后成长（从光学显微镜判断）。其次，洗涤细胞，用磷酸缓冲盐水（PBS）溶液在pH7.4和用含氟化合物通过加入混合原液至培养基的合适体积，细胞转移到0.04％DMSO培养基中，即控制最高浓度存在于测试的化学品中。为了评估PFAs对钙稳态的影响，使用选择性细胞内钙离子螯合物质 BAPTA/ AM。BAPTA/ AM溶于DMSO（原液，3mmol）然后加入到培养在2.5mu;m和0.08％的DMSO中。30分钟后用BAPTA/ AM预处理HCT116，测试化合物。
染色和钙分布的测定
早些年，Abramov、 Duchen(2003)和 Mei-Jieetal. (2004)对钙在细胞中的存在进行了使用说明修改的程序。监测细胞中的钙离子浓度，将荧光染料（Fluo-4 /AM）加入到处理后的细胞中（终浓度，1mu;M）。平行地，钙的摄取由线粒体使用RHOD-2/AM染料（最终浓度，2mu;M）进行了测量。对没有死亡的细胞染色后温育，在37℃进行30分钟，然后进行观察。连续，细胞收获并用预热的PBS洗涤两次重新悬浮于PBS中。荧光强度通过流式细胞测量，流式细胞仪与BECKTON Dickinson公司的FACS-LSRII设备（圣何塞，加利福尼亚，美国）在以下条件下检测，平均荧光强度用10000个细胞获得的激发波长在488nm和在荧光波长530/30纳米利用带通滤波器，用Fluo-4 / AM或RHOD-2 / AM染色。
计算结果表示为对照值的百分比。细胞铺到玻璃盖玻片并在12孔平板上生长（1-1.5times;10 5个细胞/ cm2），荧光显微镜测量钙的浓度。当细胞达到70-80％融合后实验。与含氟化合物培养后，Ca2 细胞用2mu;m RHOD-2 / AM培养30分钟，在37℃下，用PBS洗涤两次，并用4％多聚甲醛固定15分钟。此后，冰丙酮穿透细胞：甲醇（3:7）在零下二十度的环境下混合。这种制备的细胞被安放在来自于Sigma的安放缓冲液中（St. Louis，MO，USA）。
所有的荧光图像都是通过一个倒置显微镜获得的(Axiovert 200, Carl Zeiss, Gouml;ttingen, Germany) 配有水银灯(HBO 103)，一个Axio Cam MRm摄像头和蔡司计划复消色差透镜。用于钙分布检测滤波器是20号(Exi: 546/12 nm; Emi: 575–640 nm)。所有图片均使用微软照片编辑器3.0.2.3调整。
结果与讨论
统计分析
最终数据用扫描电镜的三个平行数据结果所得。实验数据比较是通过使用统计7.1软件中t-检验来进行的。plt;0.05在统计学意义上表示具有明显的差异。
结果
全氟化合物的脂肪酸碳链的变化对细胞内钙离子平衡能力的干扰
在我们以前的实验中我们描述了氟化碳链对膜电位或线粒体活动的影响。因此，我们研究了这种交换的影响，将四个同源酸对细胞钙稳态与细胞膜和线粒体之间的联系作了一个假设。
检测暴露于200mu;M的PFDA与200mu;M的DA中HCT116细胞，结果发现任何关于[Ca 2 ] c和对照组相比都没有明显变化，繁殖4、24、72小时后的浓度分别增加11.16%、22.67%和24.06%（图1A）。与之对照，暴露在200mu;M PFDA的线粒体中体检测到钙离子浓度发生非常明显的变化（图1B）。和对照组相比，细胞培养十二小时的情况下，它的繁殖量增加到48.23%，在相同条件下，较长时间的暴露（24和72小时），PFDA提高了2到3倍的 [Ca 2 ] m的表达量，而氟化的类似物DA却没有表现出对[Ca 2 ] m的影响在任何情况下。由此说明，线粒体作为参与诱导钙稳态的重要细胞器，在培养基中其凋亡是在钙选择性螯合剂离子为2.5mu;MBAPTA/ AM 的存在下进行的。钙离子有效地防止线粒体的过载，导致42.82％，117.18％和121.36％的释放。比较暴露在200mu;MPFDA的情况下下 24，48和72小时后， BAPTA/ AM处理后的细胞的荧光图像（图2）表明，只有200mu;MPFDA诱导线粒体钙离子随时间的增加而越来越显著。
曝光时间（h）
图1 用200mu;M的癸酸（DA）或200mu;M的全氟化类似物（PFDA）孵化HCT116细胞胞质（A）和线粒体（B）中钙的相对变化。细胞如材料和方法中描述的通过流式细胞术分析。给出的值是plusmn;3个独立实验的SEM的平均值。 *表示统计DA-或PFDA处理的细胞差异显著（pb0.005）。dagger;表示PFDA BAPTA/ AM-和PFDA处理的细胞统计学差异显著（plt;0.005）。
曝光时间（h）
图2 被RHOD-2标记的/AM用0.02％的DMSO（Ⅰ），200mu;M的DA（Ⅱ），200mu;MPFDA（III）或200mu;M的PFDA温育24小时，在HCT116细胞线粒体成像（100times;） 2.5mu;MBAPTA/AM（IV）。三个平行的一个代表性实验被示出。
全氟酸链长对钙离子分布的影响
HCT116结肠癌细胞被C6 - ，C8 - ，C10-或C12 -全氟化脂族酸处理（PFHxA，PFOA，PFDA，PFDoDA，表1）。流式细胞仪分析显示： [Ca2 ]c和[Ca2 ]m浓度的增加显著与浓度相关，与时间没有太大的关系。调节钙离子浓度分别为29.83％或26.60％当PFRDA和PFRDA浓度为400mu;M且孵化时间为四小时（图3A）。长时间保温导致[Ca2 ]c进一步降低，PFOA和PFRDA在暴露24小时后[Ca2 ]c降到31.18％和44.87％。72小时后降到35.41％和49.17% （图3B，C）。较短的C 6 -（PFHxA）和C8-chains（PFOA）不随时间造成统计上显著改变。100mu;M PFDoDA ，经过72小时培养，钙离子浓度降低32.40％（图3C）。显然，在细胞内Ca2 摄取线粒体的同时浓度降低。钙离子浓度分析显示，在400mu;M下培养4小时，大约2倍钙离子进入线粒体后（图4A）。其次，较长时间的孵化后线粒体浓度上调，72小时后，分别观察100mu;M的PFOA和400mu;M的PFOA增加97.08
剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
英语原文共 6 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[286550]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
