银杏叶精油的抗菌作用方式: 对形态和膜通透性的影响外文翻译资料

 2022-08-06 09:08

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银杏叶精油的抗菌作用方式: 对形态和膜通透性的影响

摘要 本研究旨在评价银杏叶精油对食源性病原菌的抗菌作用方式。气相色谱和质谱分析测定了34种不同的化合物，占总油量的95.4% 。银杏叶精油（1,000 micro;g /盘）具有潜在的抗菌效果，抑制区域的直径为（12.0plusmn;0.4~18.0plusmn;1.2 mm），最小抑菌浓度和最小杀菌浓度范围为250—1,000 micro;g / mL。银杏叶挥发油对病原菌的细胞活力具有潜在的抑制作用。 用银杏叶挥发油进行扫描电镜分析，发现病原菌的细胞壁有明显的形态变化。细胞外 ATP 的释放、260nm 吸收材料的增加以及钾离子对食源性病原菌的渗漏增加都证实了这种油脂对膜完整性的作用方式。

引言 食用受食源性病原菌污染的食物所导致的疾病是公共健康的一个优先关注的问题(Kordali et al. ，2005)。各种合成杀生剂被用来控制微生物的生长，减少食物中毒和腐败的发生率。然而，合成抗菌素有时与对健康的不利影响相关，这些影响鼓励了包括香精油在内的天然抗菌剂的开发(Cakir et al. ，2005; Leonard et al. ，2010)。精油是生物活性挥发物质的复杂混合物。化学香精油是萜类及其含氧衍生物。此外，植物基挥发性精油和非挥发性次生代谢产物在膳食补充剂、食品调味品和保鲜、民间医药和香料工业中有广泛的应用(Huang et al. ，2005; Kalemba and Kunicka，2003)。

银杏属银杏科，是我国传统医药中的重要药用植物。人们发现银杏叶提取物具有抗糖尿病、平喘、抗菌、保护心脏、保护肝脏和强有力的中枢神经系统活性(Pietri et al. ，1997; Mazzanti et al. ，2000; Naikand Panda，2007; Panda and Naik，2008; Sati and Joshi，2011)。银杏叶含有许多具有治疗活性的植物成分，如黄酮、二萜和倍半萜内酯，这些成分具有强大的清除活性(Braquet，1987; Kleijnen 和 Knipschild，1992; Naik 等人，2006; Kaur 等人，2012)。

本研究旨在探讨银杏叶挥发油对食源性致病菌的体外抗菌作用方式。

材料及方法

化学物品及仪器

标准的四环素和其他化学品是从 Sigma-Aldrich (美国圣路易斯)或默克(美国新泽西州)购买的。分光光度测量是使用一个96孔的微板酶联免疫吸附试验读取器(Mannedorf 台山的 Infinite M200)和一个光度计(美国维多利亚州的 Biotek 的 Synergy HT 多模式微板读取器)进行的。

植物原料和提取物

2011年11月从岭南大学的校园中收集到的银杏干叶(200克)用微波萃取仪进行了水蒸馏，时间为2小时。微波萃取设备购自杨州的韩国微波与干燥工程公司。 蒸馏物收集后与二氯甲烷混合，摇匀后保存在分液漏斗中。将含有精油的二氯甲烷下层收集起来，在室温下蒸发。 最后，油在无水 na2 so4上干燥，并保存在4 °c 的密封小瓶中，直到测试和分析。

气相色谱法-质谱联用的气相色谱-质谱分析

使用 GC / MS 系统(Jeol JMS 700质谱仪，装备了 Agilent 6890N GC) ，使用 DB-5 MS 熔融石英毛细管柱(30mtimes; 0.25 m id，薄膜厚度0.25mu;m) ，对银杏叶挥发油进行了详细的化学成份分析。气相色谱-质谱联用检测系统使用的电子电离电离能为70ev。 以氦气为载气，恒流量为1ml / min。喷油器温度和 MS 转移管温度分别设定在280℃ 和250℃。50℃的初始烘箱温度保持2分钟，然后以10℃ / 分钟的速度增加到250℃，然后在250℃保持10分钟。采用无劈裂方式人工注射1.0mu;l 稀释样品(1 / 100 v / v，甲醇)。油组分的相对百分比用峰面积归一化法表示。 香精油成分的鉴定是基于 DB-5毛细管色谱柱上的气相色谱保留时间，并利用 Wiley 和NIST文库对 GC-ms 系统进行计算机质谱匹配(Adam，2001)。

微生物菌株

本研究使用的食源性致病菌包括李斯特菌 ATCC 7644、鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 43174、大肠桿菌 ATCC 43889、金黄色葡萄球菌 ATCC 12600和蜡样芽孢杆菌 ATCC 13061。细菌病原体获自韩国食品药品监督管理局（KFDA），将其保存在4℃的营养琼脂培养基上。

抗菌活性测定

采用标准琼脂扩散法测定银杏叶精油的抗菌效果。用20ml 营养琼脂培养基制备培养皿，并进行固化。干燥平板，倒入含有107CFU/ mL 细菌悬浮液的标准接种物1ml，均匀涂抹，接种物干燥5min。采用惠特曼1号无菌滤纸片(直径6毫米)浸渍1000g/片GBEO。GBEO用5% 二甲基亚砜溶解。采用二甲基亚砜制备阴性对照品。 采用标准对照抗生素四环素(20mu;g / 碟)作为检测食源性病原菌的阳性对照。这些培养皿在摄氏37℃的环境中培养24小时。通过测定对供试菌的抑菌圈直径来评价其抗菌活性。本实验每个实验一式三份。

最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定

采用2倍系列稀释法测定银杏叶挥发油的最小抑菌浓度(Bajpai et al. ，2009).将银杏叶挥发油溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入营养肉汤培养基中培养病原菌，得到2000mu;g / ml的银杏叶挥发油，连续稀释，得到1000mu;g/ ml、500mu;g / ml、250mu;g / ml、125mu;g / ml、62.5mu;g / ml、31.25mu;g / ml、15.62mu;g / ml 和7.81mu;g / ml。每个检测的微生物10 mu;L标准悬液(大约107 CFU / ml)转移到每个试管。只含有细菌悬液的对照管在37 ℃ 下培养24小时。Gbeo的最低浓度为 MIC，经宏观评价无明显生长，以 mu;g / ml 表示。此外，鉴定了完全抑制病原菌视觉生长的浓度，并将每个培养基的50mu;l 转移到琼脂平板上，按上述时间和温度进行培养。在琼脂表面完全没有菌落生长是样品的最低浓度，被定义为最小杀菌浓度。 本实验中的每个实验重复三次。

Gbeo 对细菌致病菌活菌数的影响

在营养肉汤培养基中制备活菌，用于活菌计数测定。对于每个菌株，1ml 的活性原液转移到4ml 的营养肉汤中。所有处理的培养物在37℃下保存2小时。然后将培养物以10,000 g离心10分钟。保留沉淀，并用1mL磷酸盐缓冲盐水重悬。为了进行可行计数，每支装有蜡状芽孢杆菌ATCC 13061和大肠杆菌ATCC 43889的悬浮细菌悬浮液（约10 7 CFU / mL）的试管均以100 micro;L精油以MIC浓度接种在900 micro;L NB肉汤中，并保持在37℃。以0、40、80、120、160和200分钟的时间间隔取出用于活细胞计数的样品。 如下监测活板的计数：温育后，将100 micro;L的重悬培养物稀释到900 micro;L PBS中，稀释10倍。每种处理的100mu;L样品被稀释后，涂在营养肉汤琼脂表面。 在37℃ 孵化24小时后，对菌落进行计数(Bajpai et al. ，2009)。 在上述相同的实验条件下，对照组接种不含化合物的各菌株。 实验中每个实验重复三次。

扫描电镜分析

为了确定银杏叶精油对蜡状芽孢杆菌ATCC 13061和大肠杆菌ATCC 43889的形态的功效，使用最小抑制浓度的银杏叶精油进行了扫描电子显微镜研究。 对照样品的制备没有银杏叶精油。为了进一步观察形态变化，扫描电镜修改了 Kockro 方法(Kockro et al. ，2000; Bajpai et al. ，2009)。 采用50mM / l 磷酸盐缓冲溶液(ph7.2) ，2.5% 、100ml 戊二醛、100ml 渗透酸溶液(1%)对细菌样品进行缓冲洗涤。通过连续暴露于每乙醇浓度为50-100％的范围来对样品进行脱水。 用叔丁醇代替乙醇。 脱水后，将样品用二氧化碳（CO 2）干燥。 最后，将样品在离子镀膜机中用金溅射镀膜2分钟，然后进行显微镜检查（S-4300；日本日立市日立）。

胞外5rsquo;-三磷酸腺苷浓度的测定

为了确定银杏叶精油对细胞膜完整性的影响，根据前面描述的方法(Lee 等人，2002)测定细胞外腺苷5rsquo;-三磷酸(ATP)的浓度。将含有约10 7 CFU / mL的蜡状芽孢杆菌ATCC 13061和大肠杆菌ATCC 43889的工作培养物以1,000 g离心10分钟，并除去上清液。用0.1 mol / l 的磷酸钠缓冲液(pH 7)洗涤细胞沉淀三次，并在相同条件下进行离心。 用0.1 mol / l 的磷酸钠缓冲液和0.5 mL 的细胞悬浮液制备细胞悬浮液(107CFU / mL)。然后，将不同浓度（对照和最小抑菌浓度）的银杏叶精油加入细胞悬液中。将样品在室温下放置30分钟，以2,000 g离心5分钟，然后立即在冰中孵育以防止ATP丢失，直至进行测量。用 ATP 生物发光试剂盒(Sigma，MO，USA)测量胞外(上层)5rsquo;-三磷酸腺苷浓度，试剂盒包括含有荧光素酶、荧光素、硫酸镁、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和三磷酸盐的 ATP 试剂混合物。用亮度计(Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader，Biotek，VT，USA)测定细菌上清液中 ATP 浓度(代表细胞外浓度)。发射波长和激发波长分别为520和420 nm，激发带通和发射带通分别为1和2 nm。

260nm 吸波泡沫材料释放的测量

在无菌蛋白胨水(0.1 g / 100ml)中，加入银杏叶精油(37 ℃) ，以2ml 的菌液，测定了260nm 吸收材料蜡状芽孢杆菌ATCC 13061和大肠杆菌 ATCC 43889细胞的释放量。在处理的0、30和60分钟，将细胞以3500 g离心，并通过96孔板酶联免疫吸附测定仪（Infinite M200，Tecan，Mannedorf，瑞士）在260 nm下测定获得的上清液的吸光度。），如Carson等人（2002）所述。 类似地测试不含银杏叶精油的对照烧瓶。 结果以相对于最终时间的每个间隔中的260nm吸收材料的光密度表示。

钾离子外流的测定

使用先前描述的方法确定钾离子的量（Lee等，2002）。测定了在无菌蛋白胨水(0.1 g / 100ml)中接触银杏叶挥发油0、30、60和120min 后，蜡样芽孢杆菌 ATCC 13061和大肠杆菌 ATCC 43889细菌悬液中游离钾离子的浓度。在每个预定的时间间隔，使用钾/钾试剂盒（Quantofix，GmbH，威斯巴登，德国）通过光度法测量细胞外钾浓度。类似地测试了没有GBEO的对照瓶。结果表示为每个孵育间隔中生长培养基中细胞外游离钾的量（mmol / L）。

统计分析

所有数据通过测量三个独立的重复表示为平均 SD。 使用 SAS 软件(版本: SAS 9.2，SAS Institute inc. ，Cary，NC) ，采用单因素方差分析和 Duncanrsquo; s 检验检验5% 显著性水平下各处理间平均数差异的显著性方差分析。

图书馆搜索纯度值; b 保留时间(RT) ; c 化合物按 DB-5毛细管柱洗脱顺序排列; d 百分比基于氢火焰离子化检测峰面积归一化(n3) ; e 识别基于计算机匹配的电子电离质谱使用 Wiley 和 NIST 图书馆为 GC-MS 系统。

结果

对银杏叶挥发油进行 GC-MS 分析，鉴定出34种不同成分，占挥发油总量的95.5% (表一)。 利用微波辅助水蒸气蒸馏技术对银杏叶进行水蒸气蒸馏，得到淡黄色油，其主要成分为含有萜类及其含氧衍生物、脂肪族和芳香族碳氢化合物，以及其他一些含氧植物精油。油中主要成分为乙基对苯二甲酸(26.5%)、硼酸(6.6%)、二苯基-5- 甲基-2- 环己烯酮(6.5%)、硼酸(4.9%)、锗(4.5%)、戊烯醇(4.2%)、苯乙醇(4.1%)、苯甲烯(2.7%)、4,4-二苯基 -5-甲基-2- 环己烯酮(2.5%)、6-叠氮屈(1.9%)、1,2-二甲基喹啉(1.6%)、beta;- selinene (1.6%) ，platambin (1.0%) ，酪酸羟基甲苯(1.0%)(0.9%)和麝香草酚(0.9%)。Gbeo 中还含有芒果酮(0.7%)、 t-cadinol (0.7%)、尿素(0.4%)和酒石酸(0.4%)作为银杏叶挥发油的微量成分。

GBEO对测试的食源性致病细菌的抗菌活性通过抑制区的存在与否定性和定量地确定。 如表II所示，银杏叶精油（1,000 micro;g /碟）对经测试的食源性致病菌表现出有效的抑制作用。在该试验中，蜡状芽孢杆菌ATCC 13061，金黄色葡萄球菌ATCC 12600和单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 7644被银杏叶提取物所抑制，其病原体直径分别为18plusmn;1.2， 17plusmn;0.8、14plusmn;0.3 mm，其中大肠杆菌ATCC 43889和鼠伤寒沙门氏菌ATCC43174受到中度抑制，抑制区直径分别为14.0plusmn;0.6和12.0plusmn;0.4 mm（表II）。银杏叶精油显示出与所用浓度的标准化合物四环素相同的显着且几乎相似的抗菌作用。 在该测定中，发现银杏叶叶片精油对革兰氏阳性细菌的抑制区直径大于革兰氏阴性细

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