乳酸链球菌*属保加利亚乳杆菌中beta;-半乳糖苷酶基的构建和分泌表达
原文作者：ZHANG Wen1,3, WANG Chuan2,#, HUANG Cheng Yu1,#, YU Qian2, LIU Heng Chuan2,ZHANG Chao Wu2, and PEI Xiao Fang2
- 中国四川成都 610041，四川大学，中国西部地区公共卫生学院，营养与食品卫生学系；
- 中国四川成都 610041，四川大学，中国西部地区公共卫生学院，医学技术系；
- 中国四川成都 610213，四川石油中心局医院
摘要
目的：本研究旨在探讨乳酸乳球菌中beta;-半乳糖苷酶分泌的影响因素。
方法：将beta;-半乳糖苷酶和usp45基因克隆并插入到质粒pMG36e中来获得重组质粒pMG36e-usp-lacZ。该重组质粒转化到大肠杆菌DH5alpha;和乳酸乳球菌MG1363中。并评估和研究其酶的活性，基因测序，SDS-PAGE以及遗传稳定性。
结果：LacZ基因插入质粒pMG36e-usp-lacZ中，有99.37%与GenBank序列相似，在乳酸乳球菌MG1363 和重组质粒pMG36e-usp-lacZ之间的上清液和细胞样本中，通过SDS-PAGE显示，在116 kDa时出现明显的特异带。在乳酸乳球菌的重组质粒pMG36e-usp-lacZ的启动转化过程中，beta;-半乳糖苷酶活性测定为0.225 U／ml L，且其分泌率为10%。重组质粒pMG36e-usp-lacZ在乳酸乳球菌MG1363中显得更加稳定。
结论：作者的结论是，这些新的重组细菌能很好地表达和分泌beta;-半乳糖苷酶，表明beta;-半乳糖苷酶的表达系统构建成功，这可能提供了一种新的解决方案，尤其是对乳糖不耐受症的治疗，并推广使用转基因生物作为一般食品级质粒的一部分。
关键词 基因构建；基因表达；分泌表达；beta;-半乳糖苷酶；乳酸乳球菌
引言
乳糖不耐受（LI）是指在消化系统中由于缺乏乳糖酶而不能代谢乳糖。乳糖不耐症在许多动物中都可以发现，包括人类，它可以引起骨质疏松，缺钙和其他几个营养与健康问题的类型【1】。患有乳糖不耐症的人必须避免含乳糖的食品，如牛奶和奶制品等，这些食物一般作为人类重要的营养来源之一，特别是在发展中国家，因为它们含有优质蛋白质和各种矿物质【2】。一些因素如年龄，种族，遗传，地理环境与乳糖不耐症有联系【3】。然而，其病因仍知之甚少。据估计，在中国乳糖不耐症发生率的平均水平是，11-13岁的儿童中占30.5%，成年人中占55.1%【4-5】。由于这些原因，我们认为在中国乳糖不耐症可能是最严峻的公共健康问题之一。
beta;-半乳糖苷酶，是一种重要的酶，是一种位于人类小肠的刷状缘的黏膜双糖【6-7】。肠道微生物表达的内源性beta;-半乳糖苷酶被认为是帮助人类使用至少一部分的乳糖【8】。外源性beta;-半乳糖苷酶用于缓解乳糖缺乏受试者的乳糖不耐症。实施口服beta;-半乳糖苷酶不方便而且并没有很有效是因为这种酶不能在很长一段时间内保持其活性。因此，提高人类肠道菌群中beta;-半乳糖苷酶与选择益生菌可能是解决乳糖不耐症的一种有效方法。
乳酸菌（LAB）发酵被认为是减少牛奶中乳糖含量的一个安全和自然的生物解决方案。然而，实验室目前用于制备的发酵乳能水解小于20%的牛奶中存在的乳糖【9-10】。目前寄生在人体肠道的益生菌大多数是乳酸菌，特别是乳酸菌spp。乳酸菌促进健康的一个因素是提高对人体乳糖的处理。在乳品行业，嗜酸乳杆菌亚种保加利亚是一个最重要的复合材料发酵剂培养物之一，但不幸的是，它不能寄生在人的胃中，尽管它能在体外强烈地表达beta;-半乳糖苷酶的显著水平【25】。因此，把选定具有益生特性的乳酸菌构建作为高活性的beta;-半乳糖苷酶的一种活的输送系统，是一个有效解决乳糖不耐症问题的方法。
本研究的目的是通过插入和分泌表达信号肽usp45的上游lacZ基因，产生一个能够显著表达beta;-半乳糖苷酶的新的重组乳酸乳球菌。
材料与方法
细菌菌株、质粒和培养条件
本研究中使用的菌株和质粒于表1中列出。37°C 下在Luria-Bertani（LB）介质(琼脂和肉汤)中培养大肠杆菌；于30°C 下在Man Rogosa Sharpe (MRS)介质(琼脂和肉汤)中培养乳酸乳球菌。红霉素（中美生物技术公司，中国北京）在300mu;g／ml的大肠杆菌和5mu;g／ml的乳酸球菌的浓缩物中使用。40mu;L的20mg/ml半乳糖苷（中国大连Takara生物技术有限公司）和4mu;L的100mg/mlIPTG（异丙基-beta;-d-硫代半乳糖苷）（Takara生物技术有限公司，中国大连）是镀在琼脂上用来筛选阳性重组的寄生群。
基因组DNA的提取、usp45 和lacZ的PCR扩增
使用提取细菌DNA的试剂盒（中国上海沃森生物技术有限公司），从保加利亚乳杆菌wch9901中将基因组DNA提取出来，并且将其作为lacZ的PCR模版基因。引物lacZ f2和lacZ r2（表2）用于扩增lacZ基因。PCR反应总体积为100mu;l，包含4U Taq DNA聚合酶（中国北京天根生物科技有限公司），每对引物各1mu;mol/L（中国上海英骏生物技术有限公司），0.4 mmol/L的4dNTPs（中国北京天根生物科技有限公司），及2.5 mmol/L MgCl2 （中国北京天根生物科技有限公司）。循环体系由变性过程（94°C持续1分钟），退火过程（57°C持续1分钟），和扩展过程（72°C持续3分钟）组成。
循环PCR用于扩增usp45基因。4个引物—uspf1, uspf2, uspr1, uspr2 使用于PCR中，PCR反应总体积为100mu;l，包含4U Taq DNA聚合酶，1 mu;mol/L of uspf1 和 uspr2（中国上海英骏生物技术有限公司），0.1 mu;mol/L of uspf2 和uspr1（中国上海英骏生物技术有限公司）， 0.8 mmol/L 4dNTPs 和2.5 mmol/L MgCl2 。在PCR递归扩增中，连续执行着三种不同类型的循环：5个周期包含变性阶段（94°C持续30s），退火阶段（41°C持续30s），扩增阶段（72°C持续40s）；5个周期包含变性阶段（94°C持续30s），退火阶段（48°C持续30s），扩增阶段（72°C持续40s）；30个周期包含变性阶段（94°C持续30s），扩增阶段（72°C持续1min）。
表 1. 本研究中所使用的细菌菌株和质粒
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菌株和质粒 |
相关性状 |
来源或参考 |
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菌株 |
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E. coli DH5alpha; |
supE44 Delta;lac U169 (phi;80 lacZ Delta;M15) hsdR17 recA1 |
This laboratory |
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endA1 gyrA96 thi-l relA1 |
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L. lactis subsp. lactis MG1363 |
Derived from L. lactis subsp lactis NCDO712 by |
Prof. J. .Kok, Groningen University, Van de GM |
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plasmid curing |
et al.[20-21] |
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Lactobacillus delbrueckii subsp. |
Isolated from Hua Xi yogurt |
Ref.[12] |
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bulgaricus wch9901 |
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E. coli DH5alpha;/ pMG36e-usp-lacZ |
E. coli DH5alpha; with pMG36e-usp-lacZ |
This study |
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L. lactis MG1363/ pMG36e-usp- |
L. lactis MG1363 with pMG36e-usp-lacZ |
This study |
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lacZ |
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质粒 |
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pMG36e |
Emr; expression vector with P32 promoter, multiple |
Prof. J. Kok, Groningen University, Van de GM |
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cloning sites (MCF), and prtP translational terminator |
et al.[20-21] |
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pMG36e-usp-lacZ |
Emr, expression of usp- wch9901beta;-galactosidase |
This study |
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fusion protein |
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pMG36e和lacZ的重组[11]
usp45的119 bp片段肽和载体pUC18均用BamH I和Sac I酶切（中国大连Takara生物技术有限公司）以及使用T4连接酶来连接（中国大连Takara生物技术有限公司），获得重组质粒pUC18-usp。 然后来自保加利亚wch9901中的lacZ基因插入质粒pUC18-usp中，并且用BamHI和Sal I进行酶切（中国大连Takara生物技术有限公司），产生重组质粒pUC18-usp-lacZ。由带有Sac I 和Sal I端点的质粒pUC18-usp-lacZ酶切而获得Usp-lacZ片段，然后把这个片段连接到具有相同限制性内切酶的pMG36e 上。
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