柑橘精油对意大利青霉和绿霉的抗真菌活性研究外文翻译资料

 2023-01-10 02:01

柑橘精油对意大利青霉和绿霉的抗真菌活性研究

原文作者 Nengguo Tao, Lei Jia, Haien Zhou

单 位 School of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, PR China

摘要：使用GC / MS对柑橘精油的化学组成进行了分析。柑橘精油中最主要的化学成分是单萜烃（C10H16）（占88.96％，w / w）。柑橘精油对意大利青霉菌和绿霉菌的抑制效果随着其浓度的增大而增大。精油中对于意大利青霉菌的抗真菌活性归因于香茅醇，辛醛，柠檬醛，癸醛，壬醛，b-蒎烯，里那醇和c-萜品烯；而对于绿霉菌的抗真菌活性归因于辛醛，癸醛，壬醛，柠檬烯，柠檬醛，c-萜品烯，里那醇和a-萜品醇。精油通过其细胞质的损失和菌丝的变形来改变意大利青霉菌和绿霉菌的菌丝形态。精油显著改变了意大利青霉菌和绿霉菌的胞外电导率，细胞成分的释放以及总脂质含量。结果表明，柑橘精油通过破坏细胞膜的完整性并导致其细胞成分的泄漏，进而对意大利青霉菌和绿霉菌产生细胞毒性。

关键词：抗真菌活性；柑橘精油；细胞毒性；意大利青霉菌；绿霉菌

1.介绍

柑橘是世界上最具经济价值的水果之一。在进入市场新鲜消费之前要对采后水果进行储藏。在采后阶段，水果易受到真菌病害和生理紊乱（Scora amp; Scora, 1998）。由绿霉菌和意大利青霉菌引起的绿霉病和青霉病是柑橘类水果中的最具破坏性的采后病害（Droby et al., 2008）。为了防止果实腐烂，杀真菌剂如苯并咪唑，芳族烃和甾醇生物合成抑制剂被用作采后处理来控制这些病原菌（Yahyazadeh, Omidbaigi, Zare, amp; Taheri, 2008）。虽然化学控制剂能有效地控制柑橘中采后的绿霉和青霉病，但它们会致使人类健康风险，增加病原菌的抗真菌性，并污染周围环境（Sharma amp; Tripathi, 2006, 2008）。因此，安全以及可生物降解的替代型天然杀菌剂急需开发。

柑橘精油可以用作天然杀菌剂。精油大量存在于柑橘类水果皮中（Caccioni, Guizzardi, Biondi, Renda, amp; Ruberto, 1998）。其挥发性成分是单萜（苎烯）和倍半萜烃的混合物以及它们的氧化衍生物如醛，酮，酸，醇和酯，这取决于具体的柑橘品种和提取、分离方法（Fisher amp; Phillips, 2008）。越来越多的证据表明，柑橘精油和它们潜在的抗真菌成分可以显著抑制意大利青霉菌和绿霉菌的孢子萌发和菌丝生长（Caccioni et al., 1998; Droby et al., 2008; Wang, Tao, Huang, et al., 2012）。

椪柑（柑橘）是中国最具商业价值的柑橘类水果之一。我们以前的研究显示，椪柑精油表现出对某些相关食品腐败变质和食品安全的微生物的剧烈抗性，包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，黄曲霉菌和绿霉菌（Gao, Tao, Liu, Ge, amp; Feng, 2010; Tao, Liu, Tang, amp; Zeng, 2009; Wang, Tao, Wang, amp; Fan, 2012b）。因此，柑橘精油是一种有前途的抗菌物质来源。

本研究旨在分析椪柑的精油成分，并确定其潜在的抗真菌成分，并研究该精油对于意大利青霉菌以及绿霉菌的菌丝生长的影响效果。为阐明柑橘精油的抗真菌机制，同样研究了不同浓度的精油对于意大利青霉菌和绿霉菌的细胞膜通透性，细胞物质的释放以及其表面特性的影响。

2.材料和方法

2.1.植物材料

收获于2011年11月28日，中国，湘潭大学校园附近，当地果园（北纬27°87′，东经112°9′，海拔44米）的成熟的柑橘（椪柑）。

2.2.化学试剂

芳樟醇（95％），b-蒎烯（99％），辛烷（99％），癸醛（98％），a-萜品醇（90％），壬醛（95％），b-月桂烯（P95％）和柠檬醛（95％）购自Sigma-Aldrich公司（St. Louis, MO）获得。苎烯（99％），c-萜品烯（95％），松油烯-4-醇（95％），香茅醛（95％），香茅醇（92％），胆固醇（95％）和磷酸香草醛（98％）购自TCI上海（上海，中国）。所有试剂均为分析纯。

2.3.精油的提取和分析

将新鲜柑橘皮浸泡在1％饱和度（w/v）的氢氧化钙溶液中（P95%, Shantou Xilong Chemical Factory, Guangdong, China）8小时，以去除其中的多糖，然后在35℃下用101 -2A电热鼓风干燥箱（Zhuochi Instrument, Hangzhou, China）干燥，用FW80高速粉碎机（Taisite Instrument Company, Tianjin, China）将其粉碎成约2毫米直径的粉末。将约80g柑橘皮粉末置于烧瓶中，加入500ml双蒸水和10 g氯化钠进行蒸汽蒸馏，直到所收集的油状物体积不再显著增加。该油状物用无水硫酸钠干燥30min，用10mL二氯甲烷（CH2Cl2）提取，然后在40℃下，真空中，用R206D旋转蒸发器（Shanghai SENCO Technology Co. Ltd., Shanghai, China）浓缩萃取分离二氯甲烷。将所得到的精油储存在4℃，BCD-206TS冰箱（Hair Group, Qingdao, China）中，直至进一步分析。

主成分用GC / MS进行分析。G C分析在装有火焰电离检测器（FID）的Shimadzu QP2010 plus气相色谱仪（Shimadzu, Kyoto, Japan）上进行。使用非极性交联石英毛细管柱，HP-5MS（30 m times; 0.25 mm times; 0.25 mu;m; Agilent, Santa Clara, CA）。烘箱温度在40℃持续1min，以3℃每min的速率升温至70℃并保持在70℃1min，然后以5℃每min的速率升高至220℃，并保持10min。载气是氦气在200：1的分割比（1.2 mL min-1）。进样口温度220℃，检测器温度220℃以及注射量为1 mu;L。各组分的百分比由FID峰面积的电子积分来计算，而无需使用响应因数校正。 MS分析在配备有Shimadzu QP 2010 GC / MS系统的相同色谱仪上进行，电离电压为70伏特，离子源温度为200 ℃，质量范围为m / z 5-450，扫描间隔为0.5秒以及扫描速度是1000 amu s-1。组件识别是基于计算机与NIST08库的匹配以及保留指数（RI）与文献报道的比较（Wang, Tao, Wang, et al., 2012）。

2.4.真菌分离

所述真菌病原菌意大利青霉菌和绿霉菌从感染的温州蜜柑（温州蜜柑）水果中分离出，并保持在25plusmn;2℃，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）中。用血球计数器调节孢子浓度到5 times;105 cfu mL-1。

2.5.精油及其组成成分对菌丝生长的影响

精油及其组分（D-柠檬烯，里那醇，c-松油烯，b-月桂烯，b-蒎烯，辛醇，癸醇，a-萜品醇，萜品烯-4-醇，b-香茅醛，b-香茅醇，壬醛和柠檬醛）对于意大利青霉菌和绿霉菌菌丝生长的影响由有毒食品技术测得（Sharma amp; Tripathi, 2008）。在灭菌的培养皿（直径为90 mm）中加入PDA（20 mL），再按照以下浓度加入定量的精油：对于意大利青霉菌为0.00，0.32，0.63，1.25，2.50，5.00，和10.0mu;LmL-1,对于绿霉菌为0.00，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，和40.0mu;LmL-1。试验成分的浓度对应于精油在最小抑制浓度（MIC）的百分比。将吐温80（0.05% v/v）加入到培养基中以确保精油的均匀分布。作为对照，PDA培养皿补充有相同量的蒸馏水代替精油。在25plusmn;2℃下孵育2天后，用直尺测量菌落直径。对一式三份进行每一个处理。菌丝体生长抑制（MGI）的百分比根据下式计算（Yahyazadeh et al., 2008）：

MGI (%)=[(dc-dt)/dc]times;100

其中，dc（cm）是对照组的平均菌落直径，dt（cm）是处理组的平均菌落直径。当菌丝生长减少至对照的50％时，半数有效量（ED50）可通过回归分析确定。该完全抑制真菌生长的最低浓度即是是最小抑制浓度（MIC）。

2.6.扫描电子显微镜

用不同浓度的精油处理后的PDA上的四日龄真菌培养物（0, ED50 and MIC）用于所有的SEM观测（Yahyazadeh et al., 2008）。从PDA平板上切取约5times; 10毫米段的培养物，并迅速放置在4℃下，含有3％戊二醛的0.05M磷酸盐缓冲液（pH6.8）小瓶中。样品保持在该溶液中进行固定48小时，然后每20min用蒸馏水洗涤三次。随后，将样品置于不同浓度的乙醇系列（30％，50％，70％和95％）中脱水，在每个乙醇稀释液中20min，最后在无水乙醇中放置45min。然后样品在液态二氧化碳作用下抵达干燥临界点。将真菌段置于干燥器中直至进一步使用。干燥过后，制得的样品被安装在使用两面粘合片标准1/2英寸的SEM存根和在一个涂覆有金 - 钯电镀（60 s, 1.8 mA, 2.4 kV）的极化SEM涂装系统溅射镀膜机。所有样品中可在25千伏和5000水平的放大率下操作的JEOL JSM-6360 LV SEM（JEOL, Tokyo, Japan）中观察。

2.7.胞外电导率的测量

意大利青霉菌和绿霉菌细胞的胞外电导率的测量通过DDS-W电导率仪（上海精密科学仪器有限公司上海，中国）测定。起先，将100mu;L真菌悬浮液（105 cfu mL-1）加入到20mL马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中，并在25plusmn;2℃下在潮湿小室中温育2天。再将混合物以4000g的速率离心20min，并收集所得沉淀物，用灭菌双蒸水洗涤2-3次，再悬浮于20mL无菌双蒸水。然后，加入ED50或MIC的精油，并在25plusmn;2℃下在环境培养摇床（150rpm）下温育0，30，60或120min。同时加入吐温80（0.05% v/v）。将上清液在2950g速率下离心2min，收集后用于测量。同样测量不含精油的对照组。

2.8.细胞成分释放的测定

细胞成分释放成悬浮液是根据Paul， Dubey， Maheswari和Kang（2011）的方法测定，并做了小的修改。简要地说，从一个100mL的培养意大利青霉菌和绿霉菌的PDB培养基中取出的细胞通过在2950g离心20min后收集，洗涤三次，再悬浮在100mL的磷酸盐缓冲盐水（pH 7.0）中。然后将悬浮液分别在三种不同浓度的精油中（0，ED50和MIC），在25plusmn;2℃环境培养箱摇床（150rpm）下培养120min。同时加入吐温80（0.05% v/v）。接着，收集2mL的样品并在12,000g下离心2min。为了确定所释放的成分的浓度，使用1mL上清液，用UV-2450紫外/可见分光光度计（Shimadzu）来测量其在260nm处的吸光度。

2.9.总脂质含量的测定

在不同浓度（0，ED50和MIC）精油中培养出来的意大利青霉菌和绿霉菌细胞的总脂质含量可由磷酸香兰素方法测定（Helal, Sarhan, Abu Shahla, amp; Abou El-Khair, 2007） 。收集50mLPDB中的2日龄菌丝体并在4000g下离心10min。然后将样品用真空冷冻干燥器干燥4小时。用液氮将约0.1g干菌丝体均质化，并在干燥清洁的试管中用4.0mL甲醇 - 氯仿 -水混合物（2:1:0.8, v/v/v）剧烈摇动30min萃取。将试管在4000g下离心10min。将含有脂质的下层相与0.2mL盐水溶液彻底混合，并在4000g下离心10min。然后，将0.2mL氯仿和脂质混合物的等分试样转移至新管中，并加入0.5mL硫酸，再在沸水浴中加热10min。在这之后，加入3mL磷酸香兰素并剧烈摇动，然后在室温下培养10min。把胆固醇的标准校正曲线作为对照标准，将其在520nm的吸光度值用于计算其总脂质含量。

2.10.统计分析

通过测量三个独立重复实验，所有数据均表示为平均值plusmn;标准差。使用单向ANOVA方差分析随后进行Duncan的多重范围试验来测试在显著性水平为5％的处理之间采用SPSS统计软件包释放16.0（SPSS Inc., Chicago, IL）获得装置之间的差异的显着性。

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