α-萜品醇对绿霉的生长和形态的影响外文翻译资料

 2023-01-10 02:01

alpha;-萜品醇对绿霉的生长和形态的影响

原文作者 Guo‑xing Jing, Neng‑guo Tao*, Lei Jia and Hai‑en Zhou

摘要

背景：植物精油可以有效抑制采后病害，alpha;-萜品醇，植物精油中的一种典型的萜类化合物，在抑制绿霉上表现出较强的抗菌活性，但其可能的作用机制尚不明确。本研究评估了alpha;-萜品醇对绿霉的抗菌活性及其作用机制。

结果：结果表明，在最低抑制浓度（2.00微升/毫升）和最低杀真菌浓度（8.00微升/毫升）下，alpha;-萜品醇显著抑制P.digitatum的菌丝生长。在扫描电子显微镜下观察发现，alpha;-萜品醇通过引起细胞质的损失和菌丝体的变形，从而明显改变了P.digitatum的形态。经最低抑菌浓度或最低杀真菌浓度的alpha;-萜品醇处理后，P.digitatum细胞膜渗透性快速增加，通过细胞成分的渗出，胞外的电导率，以及胞外的pH值得以证明。 此外，alpha;-萜品醇显著引起了P.digitatum细胞内总脂含量的下降，表明经处理后细胞膜结构有所损坏。

结论：根据我们的研究，alpha;-萜品醇可能会影响细胞壁合成从而导致细胞壁的破坏。 细胞壁的破坏影响了真菌的形态，膜的完整性和细胞内的成分的渗出，这些结果表明，alpha;-萜品醇抑制P.digitatum 的生长。

关键词：抗真菌活性，细胞膜的完整性，绿霉，alpha;-萜品醇

背景

柑橘类水果在采后储藏中可被许多真菌病原体感染。 其中，绿霉是最具破坏性的病原体，在水果采后处理中造成约90％的产量损失（Droby等人。 2008年 ; Liu等人。 2010 ）。目前，采后病害主要是由合成杀菌剂来控制（Cantilde;amaacute;s等人。 2008年 ）。 然而，大量的科学兴趣已经指向这样的可替代物质，它能够通过削弱采后真菌病原体的抗性来控制该症状，并且在最近的报告(Sharma and Tripathi 2008; Viuda-Martos 等人. 2008)中阐明该杀菌剂主要基于对人类的安全和环保考虑。

在过去几十年里，使用植物精油来替代合成杀菌剂已引起了研究者们浓厚的兴趣（du Plooy等。 2009年 ; Askarne等人。 2012 ）。alpha;-萜品醇，构成许多类型植物精油的一种典型萜类化合物，据说其具有很好的抑菌活性（Park等人。 2009年 ）。Scora和Scora（ 1998年 ）发现，P.digitatum，P. italicum 和P. ulaiense在每板添加有5微升alpha;-萜品醇的抑菌区域面积分别为87，71和106平方毫米，在另一个报告中，400微克/毫升的alpha;-萜品醇对P.digitatum 的扩展速率减少了46%（Daferera等人。 2000 ）。 然而，alpha;-萜品醇抑制P.digitatum的生长的机制仍然不明确。 因此，本研究的目的是探究alpha;-萜品醇抑制P.digitatum菌丝生长的抗真菌活性，并探讨其可能的活动机制。

方法

病原体

真菌病原体P. digitatum分离自发病的柑橘，于25 plusmn; 2℃在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养，使用血球平板计数器将孢子浓度调节至5times;105 菌落单位/毫升。

化学试剂

alpha;-萜品醇（90％）购自Sigma-Aldrich公司获得（St.Louis, MO, USA）。 胆固醇（95％）和phosphovanillin（98％）购自上海TCI（上海， 中国）。

菌丝体生长的测量

alpha;-萜品醇对菌丝生长的影响是由有毒食品技术评估（Sharma和Tripathi 2008 ）。 PDA（20毫升）倒入经灭菌的培养皿（直径为90毫米），测量溶液中加入的alpha;-萜品醇的量以达到预期的浓度（0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00和 8.00微升/毫升）中。在培养基中添加有0.05％（体积/体积）的吐温-80加入。然后，在25 plusmn; 2℃下培养， 2天后测量菌落直径。 每组处理重复三次。 菌丝生长（MGI）抑制率根据以下计算式计算（Yahyazadeh等人 2008 ）：

MGI (%) = [(dc minus; dt)/dc] times; 100。 其中，dc（cm）是处理组的平均菌落直径。2天后可完全抑制真菌生长的最低浓度视为最低抑菌浓度（MIC）。在25 plusmn; 2℃下，培养72小时后可抑制病原体生长的最低浓度视为最低杀真菌浓度（MFC）。

扫描电子显微镜（SEM）观察

将在予以不同浓度（0，MIC和MFC）alpha;-萜品醇处理过的PDA上已培养4天的真菌来用于所有的SEM观测（Helal 等人. 2007;Yahyazadeh 等人. 2008 ）。 约5times;10毫米的节段切割自在PDA平板上生长的培养物，并及时放置在4℃下含有3％（体积/体积）戊二醛的0.05M磷酸盐缓冲液（pH 6.8）。 样品保持在该溶液中固定48小时，然后每20分钟用蒸馏水洗涤三次。它们在一系列乙醇下脱水（30， 50，70和95％，V体积/ 体积），每20分钟用乙醇稀释一次，最后用无水乙醇稀释45分钟。 之后样本处于液态二氧化碳干燥临界点。真菌段放入干燥器直到进一步使用时。MGI（％）= [（直流- DT）/直流]times;100 使用。 干燥后，制得的样品用两面粘合片被安装在SEM桩的标准1/2处，同时在极化SEM镀膜系统的溅射镀膜机涂覆有金 - 钯电镀（60秒，1.8毫安，2.4千伏）。所有样品置于在25千伏下5000 times; 放大的水平的JEOL JSM 6360LV SEM（JEOL，东京，日本）下观察。

细胞成分的释放的测定

按照先前描述的稍作修改的方法（Paul等人2011 ）对细胞成分的释放进行测量。 简单地说，将取自100ml马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基的P. digitatum细胞以4000g离心20分钟后收集， 用灭菌双蒸馏水洗涤三次，并再悬浮于100毫升的磷酸盐缓冲液中（pH 7.0）。在此之后，将悬浮液用各种浓度的alpha;-萜品醇（0，MIC和 MFC）处理0，30，60和120分钟。 然后，将1ml悬浮液用UV-2450紫外/可见分光光度计[SHIMADZU 国际贸易（上海）有限公司，上海，中国]在260纳米下测量吸光度。

胞外电导率和pH的测定

P.digitatum细胞pH值按照说明利用DDS-12DW电导率仪（Bante仪器 有限公司，上海，中国）和Delta;-320 pH计 （梅特勒-托利多，格里芬湖，瑞士）进行测定。P. digitatum细胞用浓度为MIC或MFC的alpha;-帖品醇处理30， 60和120分钟。 无alpha;-萜品醇的对照烧瓶中也进行测试。

总脂质含量的测定

用以不同浓度（0，MIC或MFC）alpha;-萜品醇处理的P.digitatum细胞的总脂含量利用磷酸香草醛法测量（Helal等人。 2007 ）。从50毫升PDB中收集已培养2天的菌丝体和以4000g离心10分钟 。 然后将样品用真空冷冻干燥4小时。用液氮匀浆约0.1克干菌丝体和装有4.0毫升甲醇-氯仿-水混合物（2：1：0.8，V / V / V）的清洁干燥的试管振摇萃取30分钟以提取。将管以4000g离心10分钟。然后将0.2毫升的等分试样氯仿和脂质混合物被转移到一个新的管并再加入0.5毫升浓硫酸，在沸水浴加热10分钟。之后，加入3毫升磷酸香草醛用力摇动，然后在室温下培养10 min。在520 nm处的吸光度是用于计算从以胆固醇为标准的标准校准曲线总脂质含量。

统计分析

所有的实验进行了三个生物复制并进行统计学分析（方差分析）使用社会科学统计软件（SPSS）统计软件包版本16.0（SPSS Inc., Chicago,IL, USA）。统计显著性设定为为P lt; 0.05和P lt; 0.01。

结果与讨论

菌丝体生长的抑制

如表1 所示，P. digitatum的菌丝生长受alpha;-萜品醇剂量的影响（P lt;0.01）。 高alpha;-萜品醇浓度（ ge; 2.00微升/ 毫升）完全抑制P. digitatum 菌丝生长，而在低于1.00微升/毫升这一较低浓度的alpha;-萜品醇下仅表现为抑制培养2天后的P. digitatum较温和的抗真菌作用。培养4天后的，P. digitatum菌丝生长仍然完全受8.00微升/毫升alpha;-萜品醇所抑制。因此，作用于P. digitatum的 MIC和MFC的alpha;-萜品醇的浓度分别为2.00和8.00微升/毫升。

本研究证明了alpha;-萜品醇对P.digitatum菌丝生长的有效性以及其抑制作用的强度与alpha;-帖品醇浓度呈正相关。 浓度为MIC的alpha;-萜品醇培养四天后仅表现出了部分抗真菌活性，但浓度为MFC的alpha;-萜品醇完全抑制P.digitatum 的增长（表1 ）。 这些结果与以往的研究描述的alpha;-帖品醇的抗真菌活性一致（Scora 1998年 ; Daferera等人2000 ; Park等人2009年 ）。alpha;-帖品醇的处理为限制病原体的传播以降低孢子的负荷做出贡献，并与酚羟基中含有alpha;-帖品醇芳香环的存在被认为杀真菌毒性的主要原因（Daferera等人 2000 ）。

菌丝形态，细胞成分，胞外电导率和PH的改变

菌丝形态，细胞成分，胞外电导率和PH的改变

alpha;-萜品醇的对P.digitatum形态的影响是通过SEM来检测的（图1 ）。对生长在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上的真菌具有正常，管状的，规则的，且均匀的菌丝（图 1a）。所有经浓度为MIC或MFC的alpha;-萜品醇处理的P.digitatum菌丝体形态发生了相当大的变化。经浓度为MIC的alpha;-萜品醇处理的P. digitatum呈线性的缺失和菌丝体表面疣状（图 1 b，c）。 另外，经浓度为MIC的alpha;-萜品醇处理的P.digitatum，其菌丝表现出异常的分支 （图 1 d），收缩和变形的菌丝体（图1e）。

事先用浓度为MIC或MFC的alpha;-萜品醇处理过的P.digitatum，其细胞成分释放量显著增加（P lt;0.05）。经浓度为MIC的alpha;-萜品醇处理30min过的P. digitatum的悬浮液，其OD260值为0.43，该值明显(P lt; 0.05)高于空白组(0.02)，但是又明显(P lt; 0.05)低于经浓度为MFC处理过的悬浮液。在用浓度为MIC的alpha;-萜品醇处理30min后，P.digitatum悬浮液OD260值保持平稳上升趋势，而经浓度为MFC的alpha;-萜品醇处理30min后，其经浓度为MIC或的alpha;-萜品醇处理过OD260值持续增长，在120min时达到最高的吸光度值（0.70）

虽然alpha;-萜品醇在初始时间段内未对胞外的电导率产生影响，但是经过培育30min后，alpha;-萜品醇使其值显著增加。（图 2 b）此外，整个使其保持着相当的水平。在处理120min后，经浓度为MIC和MFC的alpha;-萜品醇处理过的P. digitatum的悬浮液内的胞外导电值分别为187.7和175.5微秒/厘米，其值明显P lt; 0.05)高于空白组（70.8微秒/厘米）。

在整个实验中，空白组中的胞外PH保持着稳定的水平。经alpha;-萜品醇处理过的P. digitatum悬浮液中的胞外PH如图2c所示。相反地，经浓度为MIC和MFC的alpha;-萜品醇处理过的P. digitatum悬浮液的胞外PH在接触的前30min内快速增长，并随一系列梯度平稳增长。经浓度为MFC和MIC的处理过的P. digitatum的悬浮液在培养120min时的值分别为5.83和4.90，其值明显(P lt; 0.05)高于空白组（4.56）。

目前对alpha;-萜品醇抑制P. digitatum生长的机制了解甚少。人们普遍认为，萜类化合物的亲脂性，使他们能够优先分配至水相到真菌细胞膜的结构，导致膜膨胀，增加膜的流动性和渗透，引起离子和其他细胞内容物泄漏。(Burt 2004; Fadli 等人. 2012; Bajpai 等人2013)。

在本研究中，经alpha;-萜品醇处理过的菌丝体可观察到表面粗糙和细胞收缩，该SEM结果表明alpha;-萜品醇抗真菌毒性的活性的机制也是通过细胞增长障碍来实现的。从直线型的缺失以及终端菌丝的分支可发现影响末端菌丝顶端生长，改变壁成分的正常组装和丢失囊泡的方向性。alpha;-萜品醇的应用可能

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