Erigeroflavanone（一种来自灯盏花的新化合物）对培养的小鼠系膜细胞中过氧化氢损伤而诱导细胞死亡的保护作用外文翻译资料

 2023-01-07 10:01

Erigeroflavanone（一种来自灯盏花的新化合物）对培养的小鼠系膜细胞中过氧化氢损伤而诱导细胞死亡的保护作用

Ohn Soon Kim, Young Sook Kim, Dae Sik Jang, Nam Hee Yoo, Jin Sook Kimlowast; 韩国东方医学研究所传统韩国医学（TKM）综合研究室糖尿病并发症研究中心韩国大田Yuseong-guon Jeonmin-dong 461-24 305-811

摘要：高血糖诱导的氧化应激已被认为是糖尿病并发症的机制。氧化应激引发各类细胞的细胞死亡，包括在糖尿病肾病中起重要作用的肾小球系膜细胞。在现阶段的研究中，我们使用过氧化氢（H2O2）作为氧化应激诱导剂，研究了灯盏花素（一种来自灯盏花的新型黄烷酮衍生物）在培养的小鼠系膜细胞中潜在的细胞保护作用。我们的数据显示，过氧化氢将导致细胞活力降低，而erigeroflavanone可以减弱此效应。过氧化氢处理增加了二氯荧光素（DCF）- 敏感的细胞内活性氧（ROS）的形成，通过用剂量依赖性方式，用灯黄素预处理显著降低了这种加强ROS 形成。过氧化氢处理还诱导丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ），c-Jun 末端激酶（JNK），细胞外调节激酶（ERK）和p38以及活化的胱天蛋白酶-3的磷酸化，而用erigeroflavanone预处理则抑制了过氧化氢诱导的MAPK和胱天蛋白酶-3的活化。从这些数据我们得出结论，erigeroflavanone对系膜细胞中氧化应激诱导的细胞死亡具有保护作用，这与其抗氧化作用和MAPKs和caspase-3的抑制有关。这些结果表明，erigeroflavanone作为治疗肾脏糖尿病并发症的治疗剂具有潜力。

关键词： Erigeroflavanone； 系膜细胞细胞死亡； 糖尿病肾病抗氧化作用； MAPKs; Caspase-3

  1. 介绍

糖尿病肾病是1型和2型糖尿病的重要并发症[1]，肾小球系膜细胞在维持肾小球簇的结构和功能中起着至关重要的作用，为毛细血管环提供结构支持，并通过其收缩特性调节肾小球滤过作用[2,3]。糖尿病肾病的早期阶段的特征在于肾小球基底膜增厚和肾小球肥大[4]，但糖尿病肾病的晚期与肾小球系膜细胞和肾小球硬化的丧失有关[5]。因此，了解调节糖尿病肾病中肾小球系膜细胞数量的机制是开发有效治疗方案的重要先决条件。

通过有效的清除系统可以消除在正常氧化代谢期间产生的活性氧物质（ROS），然而ROS的产生和清除之间的不平衡可导致过量的ROS积累，导致氧化应激增加。糖尿病相关的高血糖症通过几种机制产生细胞内ROS，包括葡萄糖自动氧化[6]，刺激多元醇途径[7]，线粒体ROS过量产生[8] 和晚期糖基化终产物的形成[9]。糖尿病导致氧化应激增加，在糖尿病并发症如肾病，视网膜病变和神经病变的发病机制中起重要作用[10–12]。氧化应激会对生物分子（如DNA，脂类，蛋白质和碳水化合物）造成损害，破坏细胞稳态并产生其他产生进一步损害的ROS；最后，这些干扰会引发多种细胞类型的细胞死亡，包括系膜细胞[13–16]。现已鉴定许多信号传导途径皆为氧化应激诱导细胞死亡的关键转导物。其中一种途径是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，其在调节系膜细胞存活中起重要作用 [17]。MAPK超家族由三个主要激酶家族组成：细胞外调节激酶（ERKs ），c-Jun N 末端激酶/ 应激激活蛋白激酶（JNKs / SAPKs）和p38的MAPK，后两个家族是MAPK相关的激酶，对细胞应激有反应。半胱天冬酶或半胱氨酸 - 天冬氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡相关细胞死亡中起重要作用[18]。 半胱天冬酶作为无活性的酶原存在，其在保守的天冬氨酸残基处进行蛋白水解加工以产生活性酶。该家族成员caspase-3（CPP32 / apopain / YAMA）已被确定为肾小球系膜细胞凋亡的关键介质[15]，灯盏花被用于传统草药治疗消化不良，肠炎，流行性肝炎和血尿[19]。此外，一些报道已经证明了灯盏花及其成分的多种药理活性，包括抗动脉粥样硬化，抗增殖，抗蛋白糖化和抗氧化作用 [20–23]。 最近，我们报道了一种自灯盏花提取的新型黄烷酮衍生物 [rel- (2R, 3R)-3, 5, 7, 3rsquo;, 4rsquo;-戊羟基-2-甲氧基-黄烷酮-3-醋酸甲酯]，对醛糖还原酶和晚期糖基化终产物形成产生抑制作用，这是糖尿病机制的基础或导致糖尿病并发症的过程 [19] 。据报道，橙皮素，水飞蓟素和柚皮素是黄酮类的一个亚类，它是植物中发现的多酚类化合物，具有抗氧化活性[24–26]。这些黄酮类化合物包括erigeroflavanone含有一个或多个芳香族羟基，这是化合物抗氧化活性的原因[27]。在本实验中，我们探究了erigeroflavanone对培养的小鼠系膜细胞中氧化应激诱导的细胞毒性的功能作用。

2材料和方法

2.1物料

如前所述分离出Erigeroflavanone[19]。简言之，就是通过浸渍用MeOH萃取干燥和碾磨的灯盏花，合并萃取物在40℃真空浓缩得到MeOH萃取物，再将MeOH萃取物悬浮在H2O中，依次用正己烷，EtOAc和BuOH萃取，分别得到正己烷，EtOAc，BuOH和水溶性萃取物。使用CHCl3-MeOH梯度（从20：1至0：1，v / v）在硅胶上对EtOAc可溶的萃取物进行色谱分离，得到11个级分（E1-E11）。Erigeroflavanone (图.1A)通过Sephadex柱色谱法从级分E6中分离，用MeOH洗脱。用于细胞培养的试剂来自GIBCO BRL（Grand Island, NY, USA）。所有其他试剂，包括过氧化氢和N-乙酰半胱氨酸，来自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）。

图1. erigeroflavanone对小鼠系膜细胞活力的影响。(A)从灯盏花的花中分离的灯盏花的化学结构。(B)将细胞与指定的erigeroflavanone浓度一起温育24小时。通过CCK-8测定确定细胞活力。所示数据代表三个独立实验。数据表示为平均值plusmn; S.E.M.(n = 3)。

2.2细胞培养

SV40-转化的小鼠系膜细胞(SV40 MES 13) 获自美国典型培养物保藏中心(ATCC, ＃CRL-1927)，在Dulbecco改良Eagle培养基和含有5％热灭活的Hams F12培养基的3：1混合物中培养。而胎牛血清，14mM HEPES，青霉素和链霉素则在潮湿的5％CO2 培养箱中37℃恒温培养。将细胞接种到合适的培养皿上，在达到80％融合时用于实验。在实验前16小时，用新鲜无血清培养基替换标准培养基。

2.3细胞毒性分析

如制造商( Dojindo Laboratory, Japan )所述，使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 进行细胞毒性测定。简而言之，就是将细胞接种到每孔最终体积为100mu;l培养基的96孔板上生长。在如文中所示处理24小时后，加入10mu;l试剂盒试剂并再孵育3小时。使用酶标仪(Synergy HT, BioTek, USA)在450nm的波长下测量吸光度。

2.4细胞内ROS测定

通过DCF-DA方法测量细胞内ROS水平，其中荧光探针2rsquo;,7rsquo;-二氯双氢荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA, Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)，通过细胞内酯酶转化为2rsquo;,7rsquo;-二氯双氢荧光素，然后通过细胞内 ROS 氧化成高荧光2rsquo;,7rsquo;-二氯双氢荧光素(DCF)。处理后，用HBSS缓冲液洗涤细胞，然后在含有50mu;MH2DCFDA的HBSS缓冲液中在黑暗中温育30分钟。使用Synergy HT荧光分光光度计(激发波长485nm ，发射波长530nm)测量DCF 荧光。通过使用配备有Olympus DP 70相机的Olympus显微镜(BX51)在含有10mu;MH2DCF-DA的HBSS缓冲液中于黑暗下孵育5分钟的细胞的荧光显微镜成像来观察细胞内ROS的产生。使用所有样品的相同参数（例如对比度和亮度）来收集荧光图像，从每个样品中随机选择5组，每组10-20 个细胞，并使用Image J (NIH) 软件测量每组的平均相对荧光强度，最终取5组的平均值。所有实验重复至少三次。

2.5蛋白质印迹分析

处理后，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，用裂解缓冲液(62.5mM Tris-HCl [pH6.8]，25％甘油，2％十二烷基硫酸钠[SDS]，0.01％溴酚蓝)裂解，并煮沸5分钟。蛋白质含量是用BCA蛋白质测定试剂(Pierce, Rockford, IL, USA)测量。用含有710mM的裂解缓冲液稀释样品，通过SDS-PAGE分离beta;-巯基乙醇和等量的蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。用含有5％脱脂牛奶的TBST(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 150mM NaCl, 0.01％Tween-20)封闭膜1小时，并与适当的一抗孵育。用TBST 洗涤三次后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)一起温育1小时。用TBST洗涤三次后，用增强的化学发光试剂(Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK)检测免疫反应蛋白。通过光密度测定法(Las-3000, Fuji photo, Tokyo, Japan)使蛋白质条带可视化和定量。本研究中使用的一抗如下：磷酸-p38，磷酸-JNK ，磷酸-ERK和裂解的半胱天冬酶-3( Cell Signaling Technology , Beverley, MA, USA); 聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1; BIOMOL International , Plymouth Meeting, PA, USA);和肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。

2.6数据分析

所有实验重复3-4次，并提供代表性数据。数据使用单向ANOVA 然后进行Tukey 多重比较测试(PRISM软件, Graph Pad, San Diego, CA, USA)分析组间差异，数据表示为多次实验的平均值plusmn;S.E.M.。p lt;0.05的值被认为是统计学上具有显著差异的。

3.结果

3.1灯盏花素对小鼠细膜细胞活力的影响

为了确定erigeroflavanone是否对细胞活力有任何影响，我们对用一系列erigeroflavanone 浓度处理的培养的小鼠系膜细胞进行CCK-8测定(0-100mu;M)，并持续24小时。如图1B所示，erigeroflavanone对实验条件下肾小球系膜细胞活力无明显影响。

3.2. erigeroflavanone对高糖诱导的小鼠系膜细胞氧化应激的影响

为了研究灯盏花素在高糖诱导的氧化应激中的保护作用，我们测试了高糖处理的小鼠系膜细胞中是否会发生ROS的形成，并用H2DCF-DA检测了erigeroflavanone对ROS形成的影响。作为检测试剂。如图2所示， 高葡萄糖增加细胞内ROS水平，并且erigeroflavanone的处理显着减弱了这种增加，10mu;M的erigeroflavanone将高葡萄糖刺激的细胞内ROS水平降低至单独用高葡萄糖处理的细胞中的30％。此外，还经常使用ROS清除剂，N-乙酰半胱氨酸(NAC，1mM)并行测试。用NAC预处理也可以减弱HG导的细胞内ROS水平。这些数据表明，通过erigeroflavanone的预处理可以降低小鼠系膜细胞中高葡萄糖诱导的氧化应激。

图2.在小鼠系膜细胞中由erigeroflavanone抑制HG诱导产生的ROS。用erigeroflavanone(10mu;M)或N-乙酰半胱氨酸(NAC; 1mM)预处理细胞1小时，然后在5.6mM葡萄糖(NG)或5.6mM葡萄糖 25mM葡萄糖(HG)中培养24小时。使用荧光显微镜(A)测量检测为H2DCF-DA荧光的细胞内ROS。使用Image J软件(B)定量DCF荧光强度。所示数据代表三个独立实验。数据表示为平均值plusmn;S.E.M.(n = 3)。##plt;0.01对比NG; *** p lt;0.001 对比HG。

3.3. Erigeroflavanone抑制过氧化氢诱导的小鼠系膜细胞的细胞毒性

在随后的实验中

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