高温胁迫对淡水藻类四尾栅藻的生长及其热激蛋白表达的影响外文翻译资料

 2023-01-10 02:01

高温胁迫对淡水藻类四尾栅藻的生长及其热激蛋白表达的影响

S. ZARGAR, K. KRISHNAMURTHI, S. SARAVANA DEVI, T K.GHOSH, AND T. CHAKRABARTI*

Environmental Biotechnology Division,National Environmental Engineering Research Institute (NEERI, Nehru Marg, Nagpur-440020(MS), India

摘要

目的 为了研究不同温度（26℃, 3l℃, 33℃, 36℃和39℃）对淡水藻类四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda）热激蛋白（Hsp）的生长与表达的影响。方法 将四尾栅藻在所选温度下培养19天，分别测定温度对四尾栅藻的的生长速率（基于光密度），种群数量，叶绿素a含量和生物量的影响。为了诱导表达hsp，将藻暴露在特定温度下3h，然后置于26℃条件下继续培养6h。通过免疫检测和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测来确定Hsp在四尾栅藻中的诱导表达。结果 证明39℃下所测得的生长参数如生长速度，种群数量，叶绿素a和生物量显著降低（Plt;0.001），Hsp的表达只在39℃温度下观察到。结论 36℃可以视为四尾栅藻的正常生长的极限温度。

关键词：温度；四尾栅藻；热激蛋白（Hsp）

简介

温度作为主要的环境因子之一，在生物群落的生长、繁殖、迁移、演替以及代谢过程中起着关键性的作用[1]。一般情况下，水温升高会导致生物群包括水生生态系统中的浮游植物群落的物种组成，物种优势，现存量和生产量发生变化。因此发电厂排放的温水可能会对水生生态产生不利影响。水生生态生产力取决于浮游生物生物量的质量和数量。浮游植物作为水生生态系统食物链的最底层，其密度和生物量直接影响到整个生态系统的生物结构。每个生物体都有一系列可耐受的温度，即耐受水平。当温度过高或过低时物种的个体数量会减少，直到所剩无几甚至为零。一般生命体所耐受的温度范围较广，但每个物种都有特有的适合的温度和耐受水平[2-3]。植物和动物都有最佳的生长温度，水体温度的变化会影响水生生态系统中的生物种类和数量。

Hsp是生物体在细胞水平对外界环境刺激的一种反应，温度，化学等许多环境因素的胁迫都会诱导生物体内产生Hsp[4]。在许多模式生物研究中，分子量为90，70，60，和12-16 KDa是Hsp家族中最突出的四类，这些蛋白质常分别被称为Hsp90，Hsp70，Hsp60和小分子量热激蛋白sHsp[5]。Hsp对基因的表达调控，诱导耐热性和调控细胞凋亡方面具有重要作用。Hsp是细菌，真菌，酵母，植物和脊椎动物，包括人类在内的所有的生物中发现的高度保守的一类蛋白质[6-7]。一部分Hsp的持续表达，对细胞的正常生理，生长发育有重大意义[8]。其中植物可以就个体细胞或整个生物体对环境因子胁迫作出响应。已有文献和实验研究表明，叶绿体的Hsp参与植物的耐热性，但它们的作用位点是未知的[9]。绿色微藻作为基础生物产业和生物技术产业的资源生物具有重要价值。Sizova 等[10]对Chlamydomonas reihardtii（一种绿藻）的aph VIII基因结合核基因rbc S2，Hsp 70A，衣原体视蛋白和rbcs2基因的第一内含子等不同调控元件的表达的研究推进了藻类中选择标记核基因组的第一个稳定的酶的诞生。由于在感染浓度低于致命剂量时，Hsps可在细胞级联中极早被激活，可作为反映环境污染程度的有效生物学标志物。关于不同环境条件下的Hsp的诱导胁迫仍无深入研究。Bierkens等[11]通过研究检测pH，温度，腐殖酸，硝酸盐和磷对Raphiodocelis subcapitata（一种绿藻）的Hsp 70的合成的影响发现最终只有温度和pH能够诱导Hsp 70的合成获得耐受性。Isochrysis galbana是海洋食品链中的一种金黄色海藻和初级生产者，Wolfe 等[12]通过其的研究发现该藻可以有效地诱导Hsp 60对经过溢油和分散剂清理后的低浓度石油烃作出响应。Golldack等[13]观察到不同蛋白质诱导单细胞藻类培养盐草（Dunaliella parva）后可适应不同盐度的差异，这表明Hsp表达的差异与不同生理条件的同一物种的耐受性不同有关[14]。

本实验的主要目的是为了研究不同未达致死程度温度对四尾栅藻的存活率，生长情况和Hsp形成的影响。

材料与方法

细胞培养处理

本研究所选用的实验材料四尾栅藻作为水产食品链的重要组成部分在全世界均有分布，且易在实验室培养。四尾栅藻取自于印度Kamataka Kaiga的 Kadra水库（该水库水作为 Kaiga核电站排入冷却水），使用Chlorella的Beckers，营养液进行纯培养[15]。实验所用容器均为1L玻璃烧瓶，培养量500mL，培养液密度为每毫升4times;l04个细胞，分别在26℃，31℃，33℃，36℃，39℃条件下培养19天，每个温度设3个平行组。

参数选择

测定各生长温度下四尾栅藻的的生长速率（基于光密度），种群数量，叶绿素a含量和生物量。用在Perkin Elmer光谱仪900在560 nm处测定吸光度值。通过测定生物量反应四尾栅藻的生长，具体测定方法为取15mL样品过滤通过预先称重的微孔滤纸（GF／C；直径4.7cm），100℃烘干，最后称重结果保留到小数点后四位。测定叶绿素a含量需取15mL样品加适量MgC03溶液离心，由于色素浓度导致颜色强度不同，采用分光光度法分别在波长630 nm，647 nm，664 nm处测定吸光度值。测定不同天数的藻的种群密度采用Lackey Drop方法。利用最大比生长速率（最大值）计算实验期间每个浓度的藻类的最大生长速率，四尾栅藻在光照强度为35mu;E（12:12光／暗方案）的条件下培养。详细步骤在标准方法中有介绍[17-18]。

Hsp的表达

为测定海藻中的Hsp的诱导表达，将含有500mL试验培养液1L玻璃瓶分别置于31℃ ，33℃，36℃，和39℃的恒温水浴中热胁迫处理3h，玻璃瓶中每毫升培养液含约1times;104个细胞，每个温度设3个平行。3h后全部处理组置于26℃继续培养6h。同时热胁迫处理结束后0h，1h，3h，6h时分别取出100mL等量培养液。热胁迫期间Hsp可能不被诱导，因此热胁迫处理结束后必须采取适当措施控制实验条件保持在26℃。

蛋白定量

将每个样品在离心力1000times;g的离心机中4℃离心10min提取蛋白质。菌膜用SDS gel loading buffer{50 mmol／L Tris，HC1（pH 6.8），2%SDS，0.1%溴酚蓝和10%甘油}，冰中超声15s（20 KHz，75 W）处理，重复三次，再将匀浆置于离心力5000的离心机中4℃离心30min，运用Lowry分光光度法测上清液蛋白总浓度[19]。

SDS—PAGE/电印迹技术/免疫检测

将含有50mu;g蛋白的样品装入10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中[20]，采用电泳装置转移到硝酸纤维素膜中（Hybond ECL，Amersham Pharmacia，UK）。用电印迹设备（Western blotting）实现了实验室完成分子克隆。按照使用说明书进行进一步检测。

统计分析

所有试验均设计3组平行，运用统计软件Statistica version 5.0版进行t分布检验，计算出平均值和显著水平。

结果

四尾栅藻对高温的耐受水平

本次实验中，四尾栅藻置于26℃，31℃，33℃，36℃和39℃培养19天后，发现39℃时所测得的生长参数，即藻的密度，叶绿素a含量，生物量和生长速率（基于光密度值）均大幅下降（图1-4）。比较发现26℃条件下四尾栅藻的生长速率最大，39℃热胁迫6天后生长速率有所下降。藻的密度，叶绿素a含量和生物量经过31℃和33℃条件下处理17天后有所增加，36℃条件下处理15天和17天时均有减少。t分布检验结果显示， 31℃ ，33℃ ，36℃ ，39℃所检测到的生长参数与26 ℃条件处理的组别之间存在极显著性差异（Plt;0.001）。通过光密度测得的比增长率（mu;），26℃，3l℃，33℃，36℃，39℃条件下的最大比增长率（mu;max ）分别是0.377，0.486，0.510，0.360，0.182（图5）。26℃第3天达到最大比增长率（mu;max ），31℃第11天达到最大比增长率，说明36℃以上温度对四尾栅藻的生长不利，故36℃可视为四尾栅藻正常生长的极限温度。

Hsp的表达

另一个对四尾栅藻进行温度胁迫处理的实验中，在温度分别为31℃，33℃，36℃，39℃条件下培养3h后进一步在26℃条件下培养6h发现四尾栅藻Hsp 70只在39℃条件下表达，且39℃条件下培养的四尾栅藻经26℃处理3h和6h后所测得的Hsp表达水平均高于同一温度下培养0和1h的。对照组的表达量是最低的。

讨论

四尾栅藻对高温的耐受性

四尾栅藻约100种，广泛分布于各个淡水湖泊中，定形群体扁平，常见的为4-8个细胞的群体，其细胞成椭圆形或纺锤形，均为单核细胞，包含一个单一的纵向叠加的蛋白核叶绿体。群体中的每个细胞都能通过分裂产生子细胞，繁殖时原生质体在壁内分垂直分裂，一个单一的细胞最多能产生2，4，8，16，32个似亲孢子。

本次研究显示36℃条件下测得的四尾栅藻的生长参数表现出相当大的增长。类似的结果也在普通小球藻Chlorella vulgaris观察得出[21]。四尾栅藻的叶绿素a和生物量之间存在着一定的相关性，含51% -58%蛋白质[22]，但在一定的温度水平下难以观察到。叶绿素a的降解产物是脱镁叶绿素a，是叶绿素a卟啉环上的镁丢失形成的，与叶绿素a有相同的吸收光谱[23]。Felfoldy[26]通过对Scnedesmus obtusiuscula研究发现35℃是该藻类光合作用和生长的最佳温度。Reynold[25]研究发现羊角月牙藻Selenastrum capriocornutum在15℃到37℃条件下在均可生长，而38℃时该藻生长受阻。Margalef [26]观察到斜生栅藻在23℃生长的细胞比13.5℃条件下的小，但并没有得到干重生物量和细胞大小之间的任何相关性。

文献资料显示30℃和35℃条件下绿藻生长占优势[27] ，温度低于35℃时转板藻（绿色藻类）优势变得明显。由于生理状况差异，不同营养水平下不同物种表现出各自不同的温度耐受水平（表1）。一般情况下，细菌，蓝藻和原生动物可以耐受更高温度，可认为冷水鱼对于温度升高是最敏感的，其次是浮游动物和浮游植物。文献资料中并没有关于印度的大多数水生生物的最高温度耐受极限的记录。近期，Zargar和Ghosh[28]，Dos[29]等人对部分浮游动物和印度主要的鲤鱼品种测定其不同温度下的生长情况，其中浮游动物处理温度为26℃-31℃，鲤鱼处理温度为31℃-36℃。有时一些对某些生物种群温度耐受水平的报道是一种误导，例如硅藻的最高耐受温度为30℃[30]（表1），而Patric等人对同一物种（Nitzchia filiformis）报道称其最高耐受温度为31℃-35℃[27] （表 l）。这方面的数据需要在印度的可变环境条件研究产生，得出这些温度的必要条件对于确定水生生态系统中的生物的分布和最大允许温度极其重要。

Hsp的表达

本次研究中Hsp 70 诱导在四尾栅藻中进行，Hsp 70的诱导在微生物及人类体内均有资料证实[31]。在压力存在的情况下可形成错误折叠蛋白结合Hsp 70，Hsp 70与核糖体亚基相关。Hsp 70基因可作为绿色藻类在不同环境污染物的敏感生物标志物[11]。蓝绿色藻类集胞藻PCC6803已被用作一种模式生物研究Hsp的功能，并且当一个特定的Hsp被敲除后该藻变的热敏感[32]。Hsp的功能主要表现在一些蓝绿色的藻类，特别是颤藻，集胞藻，鱼腥藻和聚球藻等各国广泛分布的藻类[33-35]。Hsp可在细胞和机体水平诱导应激蛋白合成相关物质获得耐热能力，在今后更严峻的生存条件下提高有机体的生存能力，使其免于温度胁迫带来的直接伤害[31]。诱导Hsp70的动力学与在选定的温度水平热胁迫处理后是否相似仍然是需要进一步研究的主题。对Hsp

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