对在急性发热期使用实时PCR检测恙虫病东方体和立克次体的前瞻性评估外文翻译资料

 2022-08-06 09:08

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简报:对在急性发热期使用实时PCR检测恙虫病东方体和立克次体的前瞻性评估

Wanitda Watthanaworawit,* Paul Turner, Claudia Turner, Ampai Tanganuchitcharnchai, Allen L. Richards, Kevin M. Bourzac, Stuart D. Blacksell, and Franccedil;ois Nosten

Shoklo Malaria Research Unit, Mae Sot, Tak, Thailand; Mahidol University-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand; Centre for Tropical Medicine, University of Oxford, Churchill Hospital, Oxford, United Kingdom; Naval Medical Research Center, Viral and Rickettsial Diseases Department, Silver Spring, Maryland; BioFire Diagnostics Incorporated, Salt Lake City, Utah

摘要

本文对180例发热病人进行了恙虫病东方体和立克次体的荧光实时PCR检测来诊断立克次体感染。通过血清免疫学检测，3.9% (7/180)和6.1%(11/180)的患者分别确诊恙虫病和鼠型斑疹伤寒。使用PCR检测恙虫病东方体和立克次体具有很高的特异性（分别为99.4%[95%置信区间（CI）：96.8-100]和100%[95%置信区间：97.8-100]）。PCR检测结果也会与急性血清免疫球蛋白M（IgM）免疫荧光法（IFA）进行比较。对恙虫病东方体来说，PCR灵敏度是IgM IFA的两倍(28.6% 对比14.3%; McNemar检验 P = 0.3)。对立克次体来说，尽管在统计学意义上不显著，PCR灵敏度是IgM IFA的4倍(36.4% 对比9.1%; P = 0.08)。PCR可接受的样本有全血和白膜，但不包含血清。有必要在更大的前瞻性研究中对这些检测进行进一步评估。

一、引言

由恙虫病东方体和斑疹伤寒立克次体分别引起的恙虫病和鼠型斑疹伤寒是泰国重要的急性发热性疾病。临床诊断是困难的，因为早期症状类似于其他常见感染，如登革热，钩端螺旋体病和疟疾。实验室确认也很困难，通常需要在三级生物安全级别的细胞单层中培养传染源，或血清免疫学检测（间接免疫荧光分析）来检测抗体滴度的上升。[1-5]

二、实验材料和方法

我们用少数几种血液成分对两种实时聚合酶链反应（PCR）检测方法进行了前瞻性的评估，以此快速诊断立克次体感染。这些分析设计用于JBAIDS仪器（联合生物制剂鉴定和诊断系统；BioFire Diagnostics，Inc.（前身为Idaho Technology），犹他州盐湖城）：一个加固的便携式实时PCR系统。

来自180名患者的样本被纳入了泰国-缅甸边境不明原因发热的研究中。符合条件的患者年龄ge;5岁，患有持续时间le;7天的发热性疾病（ge;38°C），疟疾试验阴性。入组时采集静脉血（EDTA管）进行PCR，入组时采集血清，第14天进行IFA分析。血样在测试前储存在-80°C。这项研究得到泰国马希多大学热带医学院伦理委员会（MUTM 2011-008-01）和牛津热带研究伦理委员会（OXTREC 42-10）的批准。

为了比较在这些PCR中使用不同血液组分的影响，从全血（仅成人患者）、白膜（所有患者）和选定的急性血清样本（如下所述）中提取DNA。使用IT 1-2-3铂通道净化试剂盒（BioFire Diagnostics，Inc.）提取800微升全血和血清，并按照制造商的说明，使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒（德国希尔登Qiagen）提取200微升白膜。洗脱体积为200微升（全血/白膜）和100微升（血清）。

我们设计了两种基于JBAIDS的TaqMan探针的实时PCR检测方法，分别检测恙虫病（47kda外膜蛋白基因）和立克次体（17kda抗原基因）。对17kDa基因的引物和探针序列进行了轻微的修改（见参考文献6），并对其在JBAIDS平台上的使用进行了优化（r17kF4:5′-AAA-CAA-GGK-CAN-GGH-ACA-CTT-CTT-G-3′，R17KR:5′-AAG-TAA-TGC-RCC-TAC-TAC-TC-3′，RProbeV2:5′-6FAM-CCG-AAT-TGA-AGT-AAT-GC-TAMRA-3′）。检测限是通过检测至少95%的样本（即20个重复中的19个）中可检测到的最低水平的加标模板来确定的，并且发现每个反应有25个目标模板。两种靶向分析均与内抑制对照进行了重复。将DNA提取物（20微升/次）与20微升重组缓冲液一起添加到冻干试剂管中，并立即在JBAIDS仪器上进行一式两份的测试（单个反应体积20微升；DNA模板体积10微升/次反应）。阳性对照和阴性对照包括在每轮PCR循环中。JBAIDS仪器软件自动确定仪器的具体操作，即次数、温度和PCR循环次数，并决定对照反应的结果。对所有成人患者进行全血和白膜样本检测。对于儿童，由于没有足够的全血/血清需要检测，所以只检测了白膜部分。如果一名成年患者在全血或白膜中检测出恙虫病或立克次体检测呈阳性，则相应的血清样本也会被检测出来。对第一次检测结果不确定（重复反应结果不一致）的样本重复PCR。

为了进行比较，使用与基于JBAIDS的PCRs相同的DNA提取物，对白膜样本进行了三种备用立克次体实时PCR检测。如前所述，这些PCRs以恙虫病的47kda外膜蛋白基因、立克次体的17kda抗原基因和鼠伤寒ompB为靶点。用人RNaseP基因PCR作为内对照，以确定PCR抑制的缺失并监测提取效率。每25微升PCR反应加入1微升DNA模板。PCR是在ABI7500快速仪器上完成的。[6-9]

所有统计数据分析均采用STATA/SE 10.1（StataCorp，College Station，TX）进行。PCR的诊断准确率是通过将PCR结果与2times;2交叉表中的血清免疫学IFA结果进行比较来计算的。McNemar检验用于比较试验灵敏度。始终计算二项式精确置信区间。[10]

三、结果

用一对急性和恢复期血清标本间IFA免疫球蛋白M（IgM）抗体滴度升高ge;4倍来确定急性感染[11]，其中6.1%（11/180）确诊为急性鼠型斑疹伤寒，3.9%（7/180）为急性恙虫病。如前所述，以400的截止滴度作为急性感染的证据[12]，急性标本IgM-IFA对恙虫病的敏感性和特异性分别为14.3%（95%置信区间[CI]：0.4-57.9）和97.7%（95%置信区间：94.2-99.4），9.1%（95%置信区间：分别为0.2-41.3）和99.4%（95%置信区间：96.7-100）（未显示原始数据）。

用JBAIDS-PCR法检测了104份全血和180份白膜。分别用三个和六个相应的血清组分进行恙虫病和立克次体检测。当任何一个血样呈阳性时，恙虫病和立克次体总阳性率分别为1.7%（3/180）和2.2%（4/180）。

恙虫病东方体检测的特异性为：全血为99.0%（95%置信区间：94.6-100），白膜为99.4%（95%置信区间：96.8-100），所有血液成分的结果合并为99.4%（95%置信区间：:96.8-100）。使用全血、白膜和混合血液组分进行检测的灵敏度为分别为50.0%（95%置信区间：:6.8–93.2），28.6%（95%置信区间：6.8–93.2）。28.6%（95%置信区间：3.7–71.0）和28.6%（95%置信区间：3.7–71.0）。血清组分不能正确分辨全血阳性或白膜阳性的患者。共有7例患者经IgM-IFA证实为急性恙虫病感染。其中3例为儿童，仅用PCR检测白膜部分，均无阳性结果。在4例成人患者中，2例在全血和白膜中PCR均为阳性，但在血清组分中均为阴性。全血和白膜的结果有很好的相关性。另外一个没有IgM-IFA证据表明急性恙虫病感染的患者的全血PCR为阳性。

立克次体检测的特异性为100%，尽管由于检测的血清样本数量较少（N=6），血清部分结果的95%置信区间较宽（2.5-100）。使用全血、白膜、血清和联合血液组分进行检测的灵敏度分别为30.0%（95%置信区间：:6.7-65.2）、27.3%（95%置信区间：:6.0-61.0）、40.0%（95%置信区间：:5.3-85.3）和36.4%（95%置信区间：:10.9-69.2）。共有11例患者经IgM-IFA证实为急性斑疹伤寒阳性。一名患者是一名儿童，只有白膜部分通过PCR检测，结果为阴性。在10名成人患者中，4名患者全血和/或白膜的PCR呈阳性。全血和白膜的结果与相应的血清组分之间的相关性较差。

对于恙虫病东方体，PCR灵敏度是急性标本IgM-IFA的两倍（28.6%[95%置信区间：:3.7-71.0]对14.3%[95%置信区间：:0.4-57.9]；McNemar检验 P=0.3）。对于立克次体，PCR的灵敏度是急性标本IgM-IFA的四倍（36.4%[95%置信区间：:10.9–69.2]对9.1%[95%置信区间：:0.2–41.3]；P=0.08）。

从血液中检测恙虫病东方体和立克次体DNA的五种PCR方法的比较见表1和表2。恙虫病东方体PCR和47kDa PCR结果完全一致；两种PCR均为阳性（表1），阳性率为1.67%（3/180）。立克次体PCR阳性率为1.67%（3/180）。有一个尚不确定的结果被认为是阴性的，因为参考试验没有证据支持急性斑疹伤寒（表2）。然而，这一结果可以代表另一个斑点热群立克次体的感染。17kda-PCR阳性率为1.11%（2/180），ompB-PCR阳性率为1.11%（2/180）。

四、结论

我们发现恙虫病和立克次体检测都有很高的特异性，并且与交替的PCR检测有很好的相关性。临床灵敏度较低，但PCR比急性标本IgM-IFA更敏感。分子检测和抗体检测的结合很有可能是覆盖所有检测窗口期的理想选择，确诊感染足够快速，对病人管理很有帮助。在更大规模的前瞻性研究中，对这些实时PCR检测进一步评估是值得的。

参考文献

[1] Suttinont C, Losuwanaluk K, Niwatayakul K, Hoontrakul S, Intaranongpai W, Silpasakorn S, Suwancharoen D, Panlar P, Saisongkorh W, Rolain JM, Raoult D, Suputtamongkol Y, 2006. Causes of acute, undifferentiated, febrile illness in rural Thailand: results of a prospective observational study. Ann Trop Med Parasitol 100: 363– 370.

[2]McGready R, Ashley EA, Wuthiekanun V, Tan SO, Pimanpanarak M, Viladpai-Nguen SJ, Jesadapanpong W, Blacksell SD, Peacock SJ, Paris DH, Day NP,Singhasivanon P, White NJ, Nosten F, 2010. Arthropod borne disease: the leading cause of fever in pregnancy on the Thai-Burmese border. PLoS Negl Trop Dis 4: e888.

[3]Ellis RD, Fukuda MM, McDaniel P, Welch K, Nisalak A, Murray CK, Gray MR, Uthaimongkol N, Buathong N, Sriwichai S, Phasuk R, Yingyuen K, Mathavarat C, Miller RS, 2006. Causes of fever in adults on the Thai-Myanmar border. Am J Trop Med Hyg:108–113.

[4]Luksameetanasan R, Blacksell SD, Kalambaheti T, Wuthiekanun V, Chierakul W, Chueasuwanchai S, Apiwattanaporn A, Stenos J, Graves S, Peacock SJ, Day NP, 2007. Patient and sample-related factors that effect the success of in vitro isolation of Orientia tsutsugamushi. Southeast Asian J Trop Med Public Health 38: 91–96.

[5]Blacksell SD, Bryant NJ, Paris DH, Doust JA, Sakoda Y, Day NP, 2007. Scrub typhus serologic testing with the indirect immunofluorescence method as a diagn

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