酸性磷酸酶基因不同的表达和磷酸酶限制导致大量的菊苣酸在紫锥菊转基因毛状根中产生外文翻译资料

 2022-08-06 10:08

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酸性磷酸酶基因不同的表达和磷酸酶限制导致大量的菊苣酸在紫锥菊转基因毛状根中产生

摘 要

菊苣酸（CA）是从紫锥菊中获得的次生代谢产物，它是已经被发现的具有抗氧化剂和抗炎活性的HIV整合酶抑制剂。但是这种有价值的化合物低生物合成水平成为了限制进一步商业化的不可阻挡的障碍。环境带来的压力，比如磷（Pi）的缺乏，会刺激化学代谢物的合成，但会显著降低植物的生长和生物量生产。为了克服Pi限制的双重相反效应的悖论，我们对于胞内Pi供应和限制会增加紫锥菊毛状根总体CA产量的假设进行了测试。由此，利用根癌农杆菌品系R15834, 在CaMV-35S启动子下来自拟南芥AtPAP26的紫色酸性磷酸酶基因的编码序列(CDS)在紫锥菊中的表达。转基因的毛状根在pi充足的条件下培养，以增加细胞的磷酸盐的代谢。采用短期的细胞外磷酸饥饿处理用于刺激参与CA生物合成途径的基因。在pi充分条件下，AtPAP26基因的过表达显著提高了转基因毛状根与非转基因根的总酸性磷酸酶活性。除此之外，与对照组相比，转基因毛状根的总磷和游离磷水平以及根的鲜重和干重均有所增加。此外，磷酸盐的限制导致CA生物合成基因的表达水平显著升高。考虑到转基因毛状根与非转基因毛状根的生物量产量的增加，与 P条件下非转基因毛状根相比，在-P条件下生长的转基因紫锥菊毛状根的CA最终产量增加了16倍。我们的结果表明，磷酸酶基因的表达和磷酸限度对提高药用植物毛状根的最终产量和所需次生代谢物的规模化生产有显著的作用。

关键词：酸性磷酸酶活性 生物合成途径 基因表达 次级代谢产物

第一章 引言

植物次生代谢产物被认为是医药、食品添加剂、填料和工业重要生化物质的最重要来源（Zhang and Wu 2003）。菊苣酸是咖啡酸和酒石酸的衍生物，来源于紫锥菊、蒲公英叶、菊苣根、水生植物和其他食用植物（Azay-Mil-hau et al. 2013）。菊苣酸作为一种潜在的天然保健品，具有多种生物活性，特别是抗氧化反应和抗炎特性（Liu et al.2015；Zhu et al.2015）。先前的研究报道，菊苣酸抑制HepG2（肝-肝-生殖细胞癌）细胞的炎症反应，并降低胰岛素抵抗（Zhu et al.2015）。此外，菊苣酸还调节患有糖尿病小鼠的肝细胞损伤和肝葡萄糖稳态（(Zhu et al. 2017）。此外，菊苣酸通过抑制酶整合酶的活性来防止HIV的传播。这种酶能使病毒将基因组整合到受感染细胞的DNA中，是由一种逆转录病毒产生的，如HIV(Barnes et al. 2005).。菊苣酸是植物中最重要的次生代谢物之一，占紫锥菊根重的2%(Erenler et al.2015)。菊苣酸的生物合成是从莽草酸盐和佛罗里达-弗农酸盐生物合成途径产生苯丙氨酸前体开始的(Legrand et al. 2016)。菊苣酸的咖啡酰部分通过肉桂酸途径由苯丙氨酸合成(Saimaru et al. 2010)。苯丙氨酸氨解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）将苯丙氨酸九转化为香豆酰CoA(Legrand et al. 2016)。然后，香豆蔻酸3-羟化酶（C3H）和邻羟基肉桂酰转移酶（HCT）将香豆蔻酰辅酶A转化为咖啡酰辅酶A。咖啡酰辅酶A被两种未知酶转化为咖啡酸和钙(Legrand et al. 2016)。咖啡酸衍生物（CADs）是紫锥菊中的一种生物活性成分。咖啡酸衍生物中对紫锥菊用价值最重要的是CA(Liu et al. 2006; Abbasi et al. 2009)。目前，咖啡酸衍生物是从野生紫锥菊中提取的，其合成难度大、耗时长、成本高。因此，扩展紫锥菊的体外组织培养技术仍然是值得关注的研究热点(Jones et al. 2009)。

由于其生物化学和遗传稳定性，毛状根培养是一种很有前途的体外培养技术，有利于许多药用植物的生物量和次生代谢产物的持续产生(Liu et al. 2006)。在这些情况下，提高毛状根的生物量是毛状根培养最重要的目标，毛状根的生物量是通过增加原材料来增长的。磷（Pi）在保持生物体活力方面的重要作用是不可否认的（Hudson 2010）。紫色酸性磷酸酶（PAPs）基因在不同的植物中表达，以促进磷的吸收和生物量的产生(Zamani et al. 2012; Wanget al. 2014; Sabet et al. 2018; Younessi-hamzekhanlu et al.2018)。它们在酸性pH范围内催化多种磷酸酯和硬石膏来水解Pi(Tran et al. 2010)。因此，它们参与了磷效率条件下植物中Pi的获取和循环利用(Biondi et al. 1997; Bais et al. 2001)。许多研究已经报道了酸性磷酸酶（APase）活性水平与植物对磷饥饿的耐受性之间的正相关关系(Zamani et al. 2012;Wang et al. 2014; Sabet et al. 2018; Younessi-hamze-khanlu et al. 2018)。PAP家族酶分布于各种植物中，例如Gly cine max、A.thaliana和Oryza sativa的基因组分别包括35、29和26个PAP家族成员(Biondi et al.1997; Smith et al. 1997; Sharaf-Eldin et al. 2007)。关于植物中PAPs家族酶的信息很少。拟南芥主要细胞内（空泡）磷酸酶被认为是通过磷酸盐饥饿上调的，如AtPAP26(Veljanovski et al. 2006)。AtPAP26目标是细胞外分泌和空泡途径。在拟南芥中，AtPAP26也从细胞内磷酸盐代谢产物中回收磷。此外，AtPAP26的另一个作用是充当碱性过氧化物酶，这可能是活性氧代谢中的第二个作用(Veljanovski et al. 2006)。另一项研究发现，在缺乏磷的情况下，PAP26单突变体的生长受到损害(Hurley et al. 2010; Robinson et al. 2012)。此前也有研究表明，AtPAP26基因的过度表达增强了Nicotiana tabacum，A.thaliana, 和 Brassica napus的生物量生产（根和茎）(Sabet et al. 2018)。增加植物组织中次生代谢物的产生和积累，特别是在多毛根中，是许多研究中所证明的植物对胁迫的常见反应(Yukimune et al. 1996; Veerashree et al. 2012)。以前的研究者认为，植物毛状根培养也会影响次生代谢产物的积累(Liu et al. 2012; Banerjee et al. 2017)。磷酸盐限制对次生代谢物生物合成诱导的影响已经在各种研究中得到了检验(Balague and Wilson 1982; Fredeen et al. 1990; Hurry et al. 2000; Hernaacute;ndez et al. 2007; Morcuende et al. 2007; Pant et al. 2015)。限制磷酸盐的原则是，生长速率的降低导致次级代谢资源分配的增加。这通常被称为生长和次级代谢物生产之间的相反关系(Eilert 1987; Lamb et al. 1989; Martiacute;n 2004; Pant et al. 2015)。

本研究的目的是克服磷与菊苣酸之间负相关的影响，主要通过两种方法：一是将AtPAP26基因导入紫锥菊毛状根，并在毛状根中过度表达，以提高其生物量；二是利用磷限制作用刺激和上调菊苣酸的生物合成基因。

第二章 材料和方法

2.1 胚胎体外培养

紫锥菊种子(L.) Moench (Pakan-Bazr Isfahan Co., Esfahan, Iran)用70%（v/v）乙醇-水冲洗，表面用5%次氯酸钠消毒10分钟，然后用无菌水冲洗三次。无菌种子的胚用解剖分离，在Murashige and Skoog(MS)培养基（Murashige和Skoog 1962）上培养。胚胎在25℃下放置在生长室中，8:16小时的光周期下25-30天。40天时，利用健康紫锥菊幼苗叶片进行农杆菌介导的转化。

2.2 紫锥菊毛状根转基因载体的构建及再生

将AtPAP26基因全长1487bp的CDS(At5g34850)克隆到pARM1中，作为花椰菜花叶病毒35S(CaMV-35S)启动子和nopaline合成酶终止子(Tnos)的二元载体，得到了我们先前研究的pARM1-AtPAP26的最终构建体(Sabet et al. 2018)。该构建物在大肠杆菌DH5alpha;株中作为细菌宿主进行繁殖(Sabet et al. 2018)。利用发根农杆菌R15834菌株，采用冷冻-熔融转化法对紫锥菊进行转化(SambrookandRussell，2001)。在28°C温度下，在液态YEB（酵母抽提液）培养基 (Ristroph et al. 1980)以达到对数生长期(OD600=0.5–0.8)。

用解剖刀对紫锥菊外植体叶片进行损伤，然后与含有100mu;M乙酰丁香酮的pARM1-AtPAP26结构的发根农杆菌R15834悬浮培养液共培养，用手摇10分钟；用野生型发根农杆菌R15834（不含pARM1-AtPAP26载体）获得非转基因植株毛状根作为对照根。将感染的外植体转移到WPM（木本植物培养基）液体培养基（Lloyd和McCown 1980）中，在25-26℃黑暗中培养2天。将外植体转移到含3%蔗糖、0.8%琼脂和抗生素卡那霉素（50 mg l-1）和头孢噻肟（300 mg l-1）的WPM琼脂培养基中（表1）。所有样品在25-26°C和黑暗条件下在发芽器中再生（图1）。

表1紫锥菊毛状根转基因生产中接种、共培养和再生培养基的组成和最终浓度

2.3 关于转基因紫锥菊毛状根中AtPAP26基因整合的研究

利用AtPAP26基因特异性引物对转基因卡那霉素抗性毛状根进行PCR分析（表2）。此外，农杆菌rolB基因引物也用于确定毛状根（表2）。利用引物virD1扩增农杆菌高度保守的virD1区，以确认转基因根没有感染农杆菌（表2）。

图1紫锥菊毛状根在固体WPM培养基上的再生。发根农杆菌感染后20、30、40天左右

表2 PCR扩增反应中用于确认AtPAP26基因整合到紫锥菊转基因毛状根基因组的基因特异性寡核苷酸引物

2.4 实验步骤

为了解紫锥菊毛状根Logistic种群增长的不同阶段，根据毛状根在黑暗中的鲜重（FW）和WPM液体培养基中培养30天绘制了生长曲线。所有非转基因或转基因毛状根在充足的磷酸盐条件下（1.2 mM KH2PO4； P）生长20天（在对数生长期中期）。毛状根转移到缺磷状态（无磷；-P）。在缺磷处理后3h和12h取样，研究菊苣酸生物合成基因的表达水平。在饥饿处理后第3天测定菊苣酸含量。

2.5 毛状根生物量

紫锥菊毛状根的生长在含有50ml WPM的150ml锥形烧瓶中进行，毛状根用量为1g。烧瓶中含有紫锥菊毛状根，在25°C的黑暗中以110转/分的转速在旋转摇床中培养。在生长曲线对数期结束后20d，用三个平行样本测定毛状根的鲜重和干重（DW）。

2.6 磷酸盐含量及APase活性测定

用我们先前工作中描述的方法测量毛状根的细胞可溶性Pi和P的总量（Sabet et al.。2018年）。酶法测定时，将处理过的毛状根在液氮中磨成细粉。用提取缓冲液（10 mM乙酸钠，pH=5.6）将粉末样品均匀化，并在12000g下离心30分钟两次。从离心匀浆中获得的上清液用于粗酶分析。所有提取步骤均在4°C冰上进行。总酸性磷酸酶活性的测定需要用到两个两个底物，一个是以磷酸对硝基苯酯片剂（pNPP）作为一般有机底物，另一个是以磷酸烯醇丙酮酸（PEP）作为AtPAP26-specific活性的烯醇基Pi底物，（Veljanovski et al.2006年）。总酸性磷酸酶活性的定量分析是根据我们先前的研究（Sabet et al.2018年）。

2.7 菊苣酸生物合成途径中紫锥菊基因序列的预测

为了确定紫锥菊基因组中菊苣酸生物合成途径基因的候选序列，使用BLASTn（可在https://www.ncbi.nlm上获得）以及相应的鉴定基因对相关植物进行鉴定。研究了PAL、C4H、C3H、4CL和HCT等5个基因来比较非转基因和转基因毛状根中黄酮生物合成途径基因的表达水平。同时，运行BLASTx获得的每个编码序列的氨基酸序列。我们还使用最接近的参考基因组进行了SRA-BLAST（可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SRA上访问）。所有的获取的短读数都是通过密码子码校准器ver.6提取和组装的和SeqMan软件获得每个基因的预测序列，开放阅读框（ORF）使用ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/ORF Finder）确定。

2.8 RNA提取与cDNA合成

按照制造商的说明，使用总RNA提取试剂盒（Topazgene，德黑兰，伊朗）从非转基因或转基因紫锥菊毛状根组织中提取总RNA。RNA样品进一步用无RNase A的DNaseⅠ处理以消除基因组DNA污染（酵素）。利用cDNA合成试剂盒（酵素）和寡糖（dT）引物将1mu;g RNA进一步转化为cDNA。

2.9 定量实时PCR（qRT-PCR）

为了研究Pi不足条件下（Pi=0 mM KH2PO4）和Pi充足条件下（ Pi=1.2 mM KH2PO4）条件下紫锥菊菊

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