硫胺素通过部分独立于硫胺素二磷酸结合酶的机制提高了面包酵母啤酒酵母对氧化，渗透和热胁迫的抵抗力外文翻译资料

 2022-08-06 10:08

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Thiamine increases the resistance of bakerrsquo;s yeast Saccharomyces cerevisiae against oxidative, osmotic and thermal stress, through mechanisms partly independent of thiamine diphosphate-bound enzymes

硫胺素通过部分独立于硫胺素二磷酸结合酶的机制提高了面包酵母啤酒酵母对氧化，渗透和热胁迫的抵抗力

Natalia Wolak, Ewa Kowalska, Andrzej Kozik amp; Maria Rapala-Kozik

Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, Krakow, Poland

摘要

最近的许多研究已经建立了这样的假设：硫胺素（维生素B1）在不同生物体应对压力的反应中起作用，也表明潜在的机制不仅限于硫胺素二磷酸酯（TDP）在中央细胞代谢中的普遍作用。当前的工作旨在表征外源添加的硫胺素对面包酵母啤酒酵母对氧化应激（1 mM H2O2），渗透压（1 M山梨糖醇）和热应激（42°C）的响应。与在不含硫胺素的培养基中进行酵母培养相比，在存在1.4mu;M外部硫胺素的情况下，（1）在压力条件下与不受压力的对照相比，主要TDP依赖性酶的相对mRNA水平（应力/控制率）为适度降低，（2）定位于细胞质，过氧化物酶体，细胞壁和线粒体（例如，锰超氧化物歧化酶）的几种应激标记的转录水平，应力/控制率大大降低，（3）在胁迫条件下，活性氧和氮的产生明显减少，显着减轻了蛋白质的氧化。获得的结果表明，硫胺素在氧化应激条件下参与酵母细胞氧化还原平衡的维持，一部分与TDP依赖性酶的功能无关。

介绍

硫胺素（维生素B1）是所有生命的重要成分生物，主要是由于硫胺素二磷酸（TDP）在细胞代谢中的辅助因子的功能。硫胺素分子由两个取代的杂环组成环通过亚甲基桥连接（图1）。尽管结构相对简单，硫胺素只能由植物和微生物合成，而人和动物则完全依赖其营养摄入（Camiener＆Brown，1960；Kowalska＆Kozik，2008）。未能达到推荐的维生素剂量B1可能会导致一些轻微的疾病，例如胃病问题或肌肉收缩；但是，长时间缺乏会导致严重的功能障碍，主要影响神经系统和循环系统（Sriram等，2012）。长期以来，那些病理状态通过分子方面的解释仅说明了TDP的辅因子作用，但是从越来越多的最新报告中得出了一个假设关于硫胺素的非辅因子功能，尤其是其参与氧化应激反应的功能（TuncOzdemir等，2009；Goyer，2010；Tylicki＆Siemieniuk，2011;Rapala-Kozik等，2012）。

图1

硫胺素（维生素B1）和TDP在酵母细胞中的运输，分布和利用。 该方案提出了硫胺素在细胞内发生和代谢的主要途径。 TKL，转酮醇酶； PDC，丙酮酸脱羧酶； PDH / KGDH，丙酮酸和alpha;-酮戊二酸脱氢酶复合物； THI80，硫胺素焦磷酸激酶； THI7，硫胺素的质膜载体； TPC1，线粒体TDP载体

考虑到在阐明硫胺素的那些新功能方面的最新进展，硫胺素依赖于应激因素的保护机制似乎是多因素的。由于已知TDP依赖性酶（例如转酮醇酶或alpha;-酮戊二酸脱氢酶）会影响细胞的氧化还原状态（Bunik，2003；Rapala Kozik等，2008），因此它仍可以片面的与辅因子功能相关。然而，也有人提出，硫胺素可以起更直接的作用，由于其与自由基的潜在相互作用和随之而来的氧化作用，因此表现出抗氧化特性，从而导致三环硫色素的形成（Lukienko等，2000）。硫胺素生物合成途径的主要酶之一酵母THI4蛋白也被发现在硫胺素和应激反应之间存在联系，该蛋白质被证明可以保护线粒体免受不稳定条件（例如DNA破坏剂的存在）的影响（Machado等，1997年）或长期热应力（Medina-Silva等人，2006年）。其他报告提出了硫胺三磷酸（TTP）及其腺苷酸衍生物（AThTP）的信号传导功能，在某些情况下可充当“报警剂”。在大肠杆菌中，主要是在对代谢压力（如碳或氨基酸饥饿）的反应中检测到TTP和AThTP的积累（Lakaye等，2004；Gigliobianco等，2010）。

为了更详细地研究上述硫胺素的作用与整个细胞防御系统之间的关系，可以选择面包酵母的酿酒酵母实验室菌株作为可靠的模型。作为真正的真核生物，它们可用于研究基本的细胞过程，包括防御和适应各种压力条件的机制（Lushchak，2006）。最普遍的应激类型是氧化性，其特征在于细胞氧化还原状态失衡，几乎与任何硫胺素缺乏相关的疾病有关（Jhala＆Hazell，2011；Sriram等人，2012年）。潜在的机制是否涉及游离的硫胺素或其磷酸化衍生物的作用仍有待阐明。因此，目前的工作主要旨在研究硫胺素对TDP依赖性酶对TDP利用率的影响，以及对面包酵母在不同非生物胁迫条件下的抗氧化能力的影响。该研究特别关注选定蛋白质在细胞内的位置，因为知道硫胺素作用的主要靶标应加深对其分子机制的了解。

材料与方法

材料

YPD和爱丁堡基本培养基（EMM2）分别从Difco和US Biological获得。 用于分子生物学实验的试剂购自Fermentas（GeneJet RNA分离试剂盒，dNTPs），Sigma（柱上DNase，TRI试剂），Promega（M-MLV逆转录酶）和KAPA（通用SYBR Green试剂盒）。 所有其他试剂均购自Sigma。

酵母菌株和生长条件

啤酒酵母野生型BY4741菌株和硫胺素转运系统受损的突变体是从EUROSCARF获得的，并用于所有实验。酵母在标准的YPD培养基或定义的EMM2培养基（不含硫胺素，低葡萄糖）中生长，辅以不含维生素的酪蛋白水解产物（20gL-1），氨基酸（色氨酸20mgL-1、40mgL-1：蛋氨酸，亮氨酸，组氨酸），尿嘧啶（120mgL-1）和维生素（400mu;L-1吡哆醇，烟酸，泛酸，200mu;L-1核黄素和2mu;L-1生物素）在定轨振荡器上以30°C（190rpm）旋转，直至达到最佳生长阶段（实时PCR分析的OD600值为0.3–0.4，其他测定的OD600值为0.6–0.8）。通过将细胞团转移到带有选定应激源的新鲜培养基中来建立应激条件（氧化应激：1mM过氧化氢，渗透应激：1M山梨糖醇，热应激：培养基预热至42°C）。除了将山梨糖醇处理缩短到30分钟以进行实时PCR分析外，施加应激源后1小时，分析了应激处理的结果。

生长率测定

酵母在含或不含硫胺素的基本EMM2培养基中生长过夜，然后在具有选定应激因素的新鲜培养基中稀释至最终OD600值为0.2。应激处理1小时后，将酵母细胞转移到新鲜培养基中。为了监测生长速度，取出少量培养物以测量光密度。

RNA分离和定量PCR

用FastPrep仪器（6.0ms-1，45s）用玻璃珠（425-600mu;m；Sigma）和TRI试剂破坏酵母细胞。使用带有DNase处理的GeneJet RNA分离试剂盒分离总RNA，并通过在变性条件下在琼脂糖凝胶中分离来评估RNA的质量。使用2mu;g的总RNA和带有M-MLV反转录酶的dT18引物合成第一链cDNA，然后用水稀释两倍。在带有SYBR Green的步骤一仪器（应用生物系统）上进行实时荧光定量荧光标记，最终体积为10lL。表1列出了所应用的一对基因特异性引物（Genomed）。反应条件是95°C持续10分钟，然后进行40个循环：94°C持续15s，59°C持续15s和72°C持续20s。RDN18基因在所有实验中均显示为最稳定的mRNA水平，因此在所有实验中均被用作参考。还使用了RNA或水代替cDNA的适当阴性对照。mRNA水平的相对倍数变化使用2DDCT方法计算（Livak＆Schmittgen，2001）。

提取物制备和酶活性测定

用与RNA分离相同的方法破坏酵母细胞，只是用含0.5mM EDTA和蛋白酶抑制剂的100mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）代替TRI试剂（Complete;默克）。将沉淀的细胞碎片在4°C下以12000g离心15分钟，然后将澄清的上清液用于活性测量。基于k＝340nm的NADH检测，通过分光光度法测定所有TDP依赖性酶的活性（Kimmerer，1987；Gibson等，1988；Chamberlain等，1996；Tylicki等，2008）。

蛋白质氧化测定

酵母提取物的制备方法与活性测定相同，并根据制造商的说明，使用氧化试剂盒测定牛血清白蛋白作为参考，使用市售试剂盒（OxiSelectTM蛋白质羰基ELISA试剂盒；Cell Biolabs）进行蛋白质氧化分析。

检测活性氧/氮物质

用二氢罗丹明-123（DHR-123）荧光染料确定反应性物质的水平（Guidi等，2010）。酵母细胞在存在硫胺素（1.4mu;M）或不存在硫胺素的情况下生长过夜，然后用PBS洗涤两次，重悬浮于含0.4mu;M DHR-123的PBS中，最终OD600=0.8，并在黑暗中于30°C孵育10分钟。用PBS洗涤两次后，使用BioTek SYNERGY H1酶标仪（lambda;ex/em=505/535nm）在1mM H2O2存在下检测到荧光信号。

蛋白质浓度的测定

通过Bradford（1976）的方法测量蛋白质浓度。

表 1 本研究中使用的引物列表

数据分析

使用非参数Mann-Whitney检验（GRAPHPAD PRISM 6.0）对至少两个一式三份的独立实验（nge;6）进行统计分析。 图中的误差线表示标准偏差，星号表示统计显着性（P ＜0.05）。

结论和讨论

TDP在主要代谢途径中的作用已得到广泛认可（Bunik等人，2013）；然而，近年来，硫胺素在应激反应中的作用引起了人们的主要关注。对于当前的研究，我们选择了酿酒酵母的模型，对于它，其代谢途径，防御系统和调节机制都已被很好地理解。选择了三种类型的压力，分别代表酵母在其自然栖息地遇到的最常见的压力条件：氧化应激（1mM过氧化氢），渗透应激（1M山梨糖醇）和热应激（高温，42°C）。

在我们开始分析时，取决于培养基中硫胺素的可用性，确定酵母的生长速率。尽管众所周知，硫胺素的添加会加速许多微生物的生成时间（Vogl等，2008年），在文献中没有找到酿酒酵母在无硫胺素和富含硫胺素的条件下的比较生长曲线[分别为TA（-）和TA（ ）]，而实际上没有对经过发酵的酵母进行此类分析。压力条件。通过监测光密度，可以观察到即使在对照（无胁迫）条件下，硫胺素存在下的生长也更加有效，尤其是在对数中期（图2）。

图 2

面包酵母在各种非生物胁迫，氧化性（1 mM H2O2），渗透性（1 M山梨糖醇）和热性（42°C）条件下的生长，具体取决于培养基中硫胺素的可用性（0或1.4 mu;M）。 酵母在含或不含硫胺素的基本EMM2培养基中生长过夜，然后在具有选定应激因素的培养基中稀释至最终OD600值为0.2。 应激处理1小时后，将细胞转移到新鲜的EMM2培养基中，然后在k = 600 nm处监测生长速率，直到对数后期。

如所预期的，在对氧化应激的初始响应期间，酵母的生长被非常强烈地抑制。然而，在新鲜培养基中恢复细胞代谢和防御系统后，生长明显改善。在这种应力处理下，硫胺素的作用似乎特别重要，因为在TA（-）条件下的生长受到很大的损害，甚至在进入固定相时也从未达到TA（ ）培养物的密度。对热应力和渗透应力的影响较小。然而，仍然可以观察到硫胺素对应激后生长的有益作用（图2）。为了检查观察到的增长率变化是由于TDP的作用及其在细胞代谢中的有效利用，还是归因于硫胺素的保护功能，从两个主要方面进行了评估。首先，我们分析了TDP依赖性酶的mRNA水平和活性，然后我们将注意力集中在细胞防御机制上。

在应激条件下，TDP依赖性酶的转录水平会根据外部硫胺素的可用性而有所不同

为了分析硫胺素的辅因子功能，我们提到了参与细胞代谢途径的主要TDP依赖性酶。首先，我们检查了编码转酮酶（TKL1），丙酮酸脱羧酶（PDC1）以及线粒体alpha;-酮戊二酸和丙酮酸脱氢酶复合物的主要亚基（分别为KGD1和PDA1）的基因，因为它们在碳水化合物代谢中起着至关重要的作用（图1）。

实时PCR分析涉及比较应激酵母培养物和对照酵母培养物，以及具有不同硫胺素浓度的培养基之间的比较。由于所呈现数据的复杂性，已引入通用代码以促进数据解释。压力条件和非压力条件之间的每个比较都用“压力/控制”比表示（这些值在数字上以条形表示），而在硫胺素利

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