基于适配体和杂交链反应的微分脉冲伏安赭曲霉毒素分析外文翻译资料

 2022-08-06 10:08

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基于适配体和杂交链反应的微分脉冲伏安赭曲霉毒素分析

摘要

本课题研制了一种基于杂交链式反应的微分脉冲伏安传感器，测定检出限极低的赭曲霉毒素A（OTA）。在本实验中，捕获探针被固定在电极上，然后与适配体杂交，形成适配体/DNA双链。在OTA存在下，适配体-OTA复合物的形成导致适配体与电极的解离。接下来，增加了检测探针和两个hairpin-helper DNA，从而导致在电极表面通过杂交链式反应（HCR）形成扩展的dsDNA聚合物。最后，加入一种链霉亲和素碱性磷酸酶（ALP）结合物，与剩余的生物素化hairpin-helper DNA结合。该ALP水解一种合成的酶底物（alpha;-萘磷酸酯），它是电活性的，并产生示差脉冲法（DPV）电流，电流随着OTA浓度的增加而增加。在最佳条件下，电信号与OTA浓度在0.005~100ngmL-1范围内的对数呈线性关系，检出限为2pgmL-1。该方法成功地应用于谷类样品中OTA的测定。结果表明，该方法回收率满意，与高效液相色谱法结果吻合较好。

关键词：信号放大电化学传感器酶标微分脉冲伏安法

导言

赭曲霉毒素A（OTA）是一种有毒的食源性真菌毒素，主要由赭曲霉、炭曲霉和疣状青霉产生。这种有毒的代谢物污染食品商品，包括谷物、小麦、大麦、玉米、咖啡、可可和葡萄酒。OTA主要影响人类和动物的肾脏和肝脏，也可能对大多数哺乳动物产生肾毒性、致癌性、肝毒性和免疫毒性。国际癌症研究机构已将OTA列为人类的潜在致癌物（第2B组），并由几个国家和组织确定了OTA的最大耐受水平。值得注意的是，欧洲联盟委员会在几种食品中确定了OTA的最高水平，包括谷物（3.0ng·g-1）、生谷物（5.0ng·g-1）、干果（10.0ng·g-1）、葡萄酒和葡萄汁（2.0ng·g-1）。因此，开发一种灵敏可靠的检测OTA的方法，以防止食品安全恐慌和随后的经济损失是至关重要的。一些传统的用于OTA检测的标准方法包括高效液相色谱、薄层色谱和气相色谱法，这些方法能够以令人满意的稳定性和高灵敏度检测目标OTA，然而，这些常规方法需要复杂的仪器，涉及多个步骤，包括提取、复杂样品的清理和预浓缩。几种依赖于免疫学原理的快速免疫分析方法，如基于抗体的竞争性免疫分析法、免疫层析法和酶联免疫吸附法具有可靠性、简单性和对设备要求低等特点。然而，它们在生理条件下的应用受到抗体的亲和力、稳定性和修饰的影响。因此，迫切需要开发一种实用的OTA检测方法。

适配体是以核酸为基础的受体，可以结合广泛的目标分子（蛋白质、药物、氨基酸等），具有较高的特异性和选择性。目前流行使用适配体对抗OTA结合各种信号转导技术的各种快速和敏感的检测方法，如荧光，电化学，电化学发光和横向流带。在这些分析中，基于电化学的方法以其高灵敏度、高稳定性、快速传感时间和良好的可靠性而引起了人们的兴趣。在实际样品中，OTA含量总是处于超低水平，因此对电化学方法的要求很高。在此背景下，各种用于提高灵敏度的信号放大策略：包括滚动环扩增、酶标记扩增和DNA功能化金纳米粒子。杂交链式反应（HCR），其中信号链DNA分子可以编程自组装成类似于交替共聚物的缺口双螺旋，增强响应信号。此外，HCR可以在温和的条件下实现，并在信号放大方面显示出巨大的潜力。考虑到HCR和OTA适配体的优点，本课题设计了一种灵敏特异的电化学适体传感器，在较宽的线性范围内检测OTA，并且检测限低，这种传感器应该是一种稳健可靠的食品安全预防方法。

实验部分：

试剂和仪器：OTA及OTA免疫亲和柱和食品样品（阴性玉米、自然污染玉米和小麦）（购自HuaanMagnech生物技术有限公司）、6-巯基-1-己醇（购自Sigma-Aldrich）、链霉亲和素碱性磷酸酶（ST-AP）、alpha;-萘基磷酸酯（alpha;-NP）和牛血清白蛋白（BSA）。所有其他试剂均为分析试剂级，无需进一步纯化或处理即可使用。以含5.0mMMgCl2、0.1MNaCl和0.005%Tween-20的20mMTris-HCl缓冲液（pH7.4）作为洗涤缓冲液。结合缓冲液中含有10mMHEPES、120mMNaCl、5mMKCl和20mMCaCl2（pH7.0）。二乙醇胺（DEA）缓冲液中含有0.1M的DEA，1M的MgCl2和100M的KCl（pH9.6）。所有的水溶液都是用Millipore-Q

水制备的(ge;18MOmega;·cm)。由Sangon生物技术有限公司合成和纯化DNA寡核苷酸，其序列如表1所示。每个寡核苷酸加热至95℃5min，缓慢降温至室温后方可使用。电化学测试，包括微分脉冲伏安（DPV），电化学阻抗谱（EIS）和方波伏安（SWV），用AUTOLABPGSTAT302N电化学工作站（瑞士Metrohm技术有限公司）进行。以KCl饱和Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，3mm金电极为工作电极组成的三电极体系。

电化学测量：所有的电化学实验都是在一个含有三电极排列的常规电化学电池中进行的。在含有0.5MKCl的3mL5mMK3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]溶液中进行EIS，频率从0.1~105Hz。在含有0.5MKCl的3mL5mMK3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]溶液中进行SWV，扫描速度为0.04V/s，从0.0V扫描到0.5V。在含1mg·mL-1alpha;-NP的3mL0.1MDEA缓冲液（pH9.6）中进行DPV测定,电位范围从0.0V到0.5V，调制幅度为0.07V，调制时间为0.05s，间隔时间为0.2s。所有测量均在室温下进行。

OTA电化学传感器的制备:使用前，用0.05mu;m氧化铝粉抛光电极至镜面，在去离子水中超声处理三次。为了去除所有污染物，电极在食人鱼溶液（H2SO4：H2O2=3：1）中浸泡10分钟，用去离子水冲洗，并在室温下干燥。将10mu;L500nM硫醇化捕获探针小心地滴在预处理的金电极表面，然后在4℃下孵育一夜。用洗涤缓冲液洗涤后，用1mMMCH覆盖电极，室温保存1h，堵塞剩余裸露区域。然后，用500nM适配体溶液10mu;L在37℃下处理电极1h。随后，在电极上加入含有不同OTA浓度的10mu;L结合缓冲液，然后在37℃下孵育1h。制备的aptasensor在37℃下孵育1h，用500nM生物素化检测探针的10mu;L孵育。然后用含有5mu;Lhairpin-helper 探针生物素-H1（2mu;M）和5mu;L生物素-H2（2mu;M）的混合液体孵育1h，每步后用洗涤缓冲液冲洗电极三次。最后，在含有1.25mu;g·mL-1ST-AP和8mg·mL-1BSA的DEA缓冲液中处理10mu;L，阻断非特异性结合位点，以确保ST-AP与生物素特异性结合。然后用DEA缓冲液彻底清洗传感器。在含有1mg·mL-1alpha;-NP的DEA缓冲液中检测电化学信号。

实物样品准备：20g阴性玉米样品与5gNaCl置于塑料离心管中，然后与100mL甲醇-水溶液混合（v/V=80/20）。然后将无OTA的玉米样品加入适量的OTA，并剧烈摇动10分钟。在4000rpm（离心力为6800times;g）下离心10分钟，上清液通过微纤维玻璃过滤器（Whatman934-AH）过滤，去除固体物质。随后，用40mL去离子水稀释10mL滤液。将25mL的样品通过免疫亲和柱过滤，流速约为每秒一滴，用10mL去离子水洗涤两次，以去除干扰化合物。最后用2mL甲醇-乙酸（v/v=49/1）洗脱吸附的OTA，在管中收集。用结合缓冲液将所得的OTA样品溶液稀释至不同浓度。对自然污染的玉米和小麦样品的预处理方法与阴性玉米样品的预处理方法相同，但添加程序不同。所有样品均置于4℃下以供进一步使用。

结果和讨论：

用于OTA检测的aptasensor设计：方案1说明了aptasensor用于OTA检测的生物传感机制。传感原理是基于形成OTA-适配体复合物和HCR放大信号的构象变化。捕获探针通过Au-巯基相互作用固定在金电极表面，然后与互补的OTA适配体杂交形成适配体/DNA双链。在OTA存在的情况下，OTA和捕获探针之间发生了竞争适配体，这导致适配体与电极表面的解离，因为适配体与OTA之间的相互作用强于适配体/DNA双链。然后，生物素化检测探针与电极表面捕获探针的其余部分杂交。最后，检测探针和两个hairpin-helper DNA通过电极表面的HCR形成扩展的dsDNA聚合物。hairpin-helper DNA在末端用生物素标记，为ST-AP提供了巨大的锚定位点，并实现了信号放大。因此，OTA检测可以通过对aptasensor获得的电化学信号进行监测来实现。结果表明，HCR是一种可靠灵敏的OTA分析平台。

方案1说明了使用HCR进行放大的策略的示意图。在OTA存在下，适配体OTA复合物的形成导致适配体与电极的解离。然后生物素-DP和两个hairpin-helper DNA允许信号放大。OTA的浓度是与电化学信号成正比。

图1：与OTA（d）反应后的裸GE（a）、捕获探针修饰电极（b）、适配体的dsDNA和捕获探针修饰电极（c）的EIS（a）和SWV（b）、捕获探针的dsDNA和检测探针组装Ge（E），与H1和H2（F）的混合物杂交，加入ST-AP（G）在5mM[Fe(CN)6]3-/4-含0.5MKCl中进行杂交。

逐步修饰电极的表征：为了表征修饰电极的界面特性，通过EIS和SWV测量，研究了传感界面的组装步骤。图中示出了含有0.5MKCl的5mMK3[Fe(CN)6]的不同制备电极的EIS谱.1(a)裸金电极在阻抗谱（曲线a）的Nyquist图中显示了一条几乎直线，这是扩散控制过程的一个特征。硫醇捕获探针固定后，得到一个小的半圆直径，电子转移电阻（RET）值增加（曲线b）。当捕获探针与适体杂交时，RT进一步增强，半圆直径显著增加（曲线c）。随后，在aptasensor与10ng·mL-1的OTA反应后，RT和半圆的值变小（曲线d）。适体被迫与适体/DNA双链分离，并在液体中形成适体/OTA复合物。然后，在连续组装检测探针（曲线e）后，电阻随半圆直径的增加而增大。然后观察到一个更大的半圆结构域时，电极与H1和H2孵育HCR（曲线f）。在电极界面上检测到较高的电阻，这可能是由于双螺旋共聚物阻碍了电化学探针的电子转移。最后，加入ST-AP后，半圆域达到最大值（曲线g）。这些EIS结果与SWV获得的结果一致（图1）。其中峰值电流随组装、解离和杂交过程而变化。EIS和SWV的结果都表明，aptasensor确实按照主方案中的描述工作。

此外，我们还加入了琼脂糖凝胶电泳，再次验证了该策略。琼脂糖凝胶电泳CP（lane1）、CP和适配体的DSDNA（lane2）、与OTA（lane3）反应后的CP适配体、CP和DP的DSDNA（lane4）、与H1和H2杂交的CP-DP（lane5）在图2中显示为lane1，lane2显示捕获探针与适配体杂交成功。Lane3显示适体-OTA复合物导致适体与CPaptamer的dsDNA解离。Lane4与Lane5表明捕获探针先后与DP和H1-H2杂交。因此，琼脂糖凝胶电泳每一步杂交都是成功的。

图2CP的2琼脂糖凝胶电泳（lane1）、CP和适配体的dsDNA（lane2）、与OTA反应后的cp-适配体（lane3）、CP和DP的dsDNA（lane4）、与H1和H1杂交的cp-DP（lane5）

图3a设计的目标不同OTA浓度的aptasensor的DPV曲线0,0.005,0.01,0.1,0.5,1,10,

100ng·mL-1（从a到h）。b在HCR存在（a）和不存在（b）的情况下，DPV峰值电流与不同OTA浓度的对数关系图。

方法的优化：优化以下参数生成稳定灵敏的方法：（a）检测探针浓度；（b）hairpin-helper探针浓度；（c）HCR孵育时间；（d）alpha;-萘基磷酸酯浓度与各日期及(图S1)载于电子附表材料。

我们发现了以下实验条件，以获得最佳结果：（A）检测探针浓度为500nm；（B）hairpin-helper探针浓度为1mu;M；（C）HCR孵育时间为60min；（D）alpha;-萘基磷酸酯浓度为1mg·mL-1。

传感器的分析性能：

用于OTA检测的传感器灵敏度：

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