从海洋环境中分离的本地海洋球菌MAR2于四氢嘧啶的生产外文翻译资料

 2022-08-06 11:08

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从海洋环境中分离的本地海洋球菌MAR2于四氢嘧啶的生产

一、摘要

四氢嘧啶促进了护肤品和化妆品的发展。在本研究中，我们采用响应面分析法和分批补料策略，通过优化培养基成分，利用海洋细菌株marinoccussp.MAR2来提高四氢嘧啶的产量。最陡上升和中心复合设计的结果表明，54g/L酵母提取物、14g/L醋酸铵、74.4g/L的谷氨酸钠和6.2g/L的柠檬酸钠构成了最大四氢嘧啶产量（3.5g/L）的最佳培养基。此外，我们在生物反应器中进行了补料分批培养，将pH值和溶解氧结合，用marinoccusmar菌株生产胞外碱。采用分批补料培养法，可使四氢嘧啶产量、含量和产率分别达到5.6g/L、10%和3.9g/L/天。因此，利用RSM和补料分批策略，由marinoccussp.MAR2生产的四氢嘧啶显示了其工业化生产的潜力。

二、简介

四氢嘧啶（1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸）是一种天然的环状氨基酸衍生物，是一种与细胞相容的溶质，对许多细菌细胞起到保护作用。四氢嘧啶可以作为渗透调节溶质，通过细胞质中的盐和有机渗透调节细胞的机制来平衡细胞和周围环境之间的渗透压。它首先在外源性盐藻—一种极端嗜盐的光营养细菌中被发现，此后在广泛的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中发现，如短杆菌属、长型嗜盐单胞菌、斯图泽里假单胞菌和嗜盐海洋球菌。四氢嘧啶的多功能作用，如防止电离辐射的DNA，防止紫外线对皮肤细胞的损伤和保湿作用，促进了广泛的护肤品和化妆品产品的开发。此外，在化疗过程中，外甾体也被用作健康细胞的保护剂。在之前的研究中，我们分离出一种嗜盐细菌Marinococcus sp。ECT1，来自台湾南部的一个咸水环境。这种微生物可以合成和积累细胞内的外源蛋白，作为一种相容的溶液来抵抗高渗环境中的渗透胁迫。我们还评估了由Marinococcus sp.ECT1合成的胞外碱的分子量和化学结构。此外，当温度、pH值、发酵温度、发酵时间等条件下，胞外碱的生产是最适的，搅拌速度分别保持在301C、pH 7和200rpm。提高外源蛋白产量的传统方法是优化单一因素，如碳源类型，而其他因素保持不变。然而，这一策略无法揭示所涉及的不同因素的综合影响。因此，统计实验设计，如响应面法（RSM），将需要消除许多实验的需要，以优化不同的因素，以最大限度地生产外阴素。RSM是建立经验模型的数学和统计技术的集合。精心设计的实验的目的是优化由许多自变量决定的响应。很少有研究使用RSM来优化体外素的生产。Van Thuoc等人在使用RSM优化生长培养基成分后，使得玻利维亚盐单胞菌的胞外碱产量增加到1.27g/L。Bergmann等人利用RSM优化了嗜碱碱碱杆菌DSM 5271T的生长条件，使其体外产碱量由0.15g/L提高到0.2g/L。

细菌挤奶的过程已经过时，且在工业上已经很长一段时间没有使用了。在嗜盐菌的工业菌株中，细菌被用来不断地向培养基中分泌外源蛋白。然而，在产量和生产率方面仍有一些研究有待完成。胞外激素的产量与细胞生长密切相关，因此，控制细胞生长是优化胞外激素产量的关键因素。本研究采用分批补料培养策略，将pH值和溶解氧控制在一起，以提高四氢嘧啶的产量。使用这种策略可能会促进细胞的高生长，从而促进外激素的积累。优化补料分批培养的条件，才能在各个步骤中保持较高的生产效率。

图1 四氢嘧啶的化学结构

三、材料与方法

从台湾南部海洋环境中分离到一株革兰氏阳性菌，经16srdna系统发育分析鉴定为marinoccussp.MAR2。本研究测定的marinoccussp.MAR2的16srdna序列已存入国家生物技术信息中心GenBank数据库，文号为MG745359。marinoccussp.MAR2能在高渗环境中合成和积累胞内外质作为抗渗透胁迫的相容性溶质。marinoccus sp.MAR2在30℃和200rpm的基础培养基上预培养12h，然后接种到设计的培养基（5%接种液）中进行分批发酵，产生胞外毒素。培养Marinococcus sp.MAR2的基本培养基包括酵母提取物（5g/L，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，US）、醋酸铵（5g/L，Sigma）、四水氯化亚铁（0.2mM，Sigma）、一水硫酸锰（2lM，Sigma）、氯化钾（2g/L，Sigma）、七水硫酸镁（80mM，Sigma）、柠檬酸钠（3g/L，Sigma）、谷氨酸钠（1g/L，Sigma）和氯化钠（200g/L，Sigma）。

3.1 响应面法优化介质

我们先前的实验结果表明，培养基的组成可以影响Marinococcus sp.ECT1菌株的胞外蛋白产生。因此，本研究进一步测试了培养基的组成对Marinococcus sp.MAR2胞外蛋白产生的影响。发酵培养基中的八个核心成分（酵母提取物、醋酸铵、四水氯化亚铁、一水硫酸锰、氯化钾、七水硫酸镁、柠檬酸钠，选择谷氨酸钠）作为靶参数。采用基于Plackett-Burman设计方法的两级析因设计来选择影响异位素生产的最重要参数。

3.2 最陡的上坡路

在两级阶乘设计后，采用最陡上升路径法确定关键参数的范围，并采用RSM方法，利用JMP软件（3.2.2版，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）基于Box-Behnken设计算法设计实验。最陡上升路径法是RSM的第一步，用于探索当前运行条件附近的区域，确定重要因素确定后目标条件必须向最优区域移动的方向。通常，在当前的运行条件下，一阶就足够了，因为运行条件通常远离最佳响应条件。实验必须以尽可能少的实验以最有效的方式从当前的操作条件转移到最佳区域。当这种一阶回归模型在当前操作条件下不足以满足要求时，则使用一个更复杂的模型，即Box-Behnken设计来满足条件。Box-Behnken设计是一类基于三级不完全因子设计的可旋转或近似可旋转二阶设计。在此基础上，通过建立描述响应面的二阶多项式方程，进行逐步回归分析。然后确定产生最大浓度的蜕皮激素的关键参数的最佳值。

3.3 补料分批操作

利用marinoccus sp.MAR2进行的外毒素生产的补料分批操作是使用5-L生物反应器进行的，补料分批操作的总体实验设计如图2所示。将预培养的marinoccusspmar2接种于5L发酵罐中，接种量为10%（v/v）。发酵初始条件为：工作容积3L，pH值7.5，搅拌速度300rpm，溶解氧60%，温度37℃。分批投料时，酵母抽提物作为投料基质进入发酵罐。溶氧量由纯氧和搅拌控制。采集液体样品以测量生物量浓度、胞外碱产生量和胞外碱含量。

图2 利用marinoccussp.MAR2进行外用碱补料分批操作的总体实验设计

3.4 细胞浓度测定

采用紫外可见分光光度计，在波长为600nm（OD600）的条件下，测定了烧瓶和反应器中微生物培养物的生物量浓度。对样品进行稀释，以确保吸光度与生物量浓度呈线性相关。使用以下校准公式：DCWfrac14;=0.72times;OD600 1.31将OD600值转换为干电池重量（DCW）。为了保证转换因子的准确度，对DCW和OD600进行了多次标定。

3.5 四氢嘧啶测定法

MAR2培养24小时后，进行体外提取和测定。用8000times;g离心法分离颗粒，然后在乙醇（Sigma）中再悬浮30分钟，乙醇提取物通过0.45-lm过滤器过滤，以分析粗胞质的产生。然后在RP-18柱（Merck，Darmstadt，Germany）上用高效液相色谱法（Hitachi，Tokyo，Japan）对20lL样品进行分析，使用Malin等人描述的改进版方案。接下来，以乙腈/三氟乙酸盐（4/1[v/v]；pH值为1/2.5）（Sigma）为流动相，以流速为1 ml/min等比例进行色谱分析。在210nm处用紫外/可见光检测器（日立）监测了该外星碱。以从Sigma公司购买的克托宁为标准品。

四、结果和讨论

4.1优化培养基组成提高体外素产量

4.1.1 二级阶乘设计

采用两级析因设计，分析了8个关键变量对marinoccussp.MAR2胞外毒素产生的影响。该模型的决定系数（R2）为0.959，说明关键变量占变异的95.9%以上，模型不能解释总变异的4.1%。此外，在所检测的8个变量中，有4个（酵母提取物[p值lt;0.001]、醋酸铵[p值lt;0.0031]、谷氨酸钠[p值lt;0.0159]和柠檬酸钠[p值lt;0.0466]）显著影响了胞外碱的产生。因此，选择酵母提取物、醋酸铵、谷氨酸钠和柠檬酸钠的浓度值作为响应面分析的自变量。

4.1.2 最陡上升法

尽管分数阶阶乘是筛选变量的有用工具，但它不能用于预测变量的最佳水平或确定设计RSM所选变量的适当范围。因此，采用了最陡上升法。确定了最陡上升的路径，以找到适当的方向，在这个方向上，需要改变变量，以提高外胚叶的产量。在进行第18步时，外毒素产量最高（约3.2g/L）。然而，在第24步时，外啡碱的产量急剧下降至1.5g/L左右。还发现，在第十八步达到最大产率。因此，通过RSM设计，选择这些变量进行进一步优化。式（1）如下所示，由分数阶乘设计的结果计算得出。

其中Y表示胞外氨酸产生量，X1、X2、X3和X4分别是酵母提取物、醋酸铵、谷氨酸钠和柠檬酸钠浓度的编码值。

基于部分因子设计和最陡上升法的结果，使用四个变量（酵母提取物、乙酸铵、谷氨酸钠和柠檬酸钠）显著影响了蜕皮激素的产生，以确定最佳的培养基组成以使蜕皮激素的产量最大化。通过RSM的Box-Behnken设计，确定了4个因子的最佳水平以及4个因子之间的相互作用对胞外碱产量的影响。Box-Behnken设计的结果采用标准方差分析进行分析。采用酵母抽提物（X1）、醋酸铵（X2）、谷氨酸钠（X3）和柠檬酸钠（X4）的不同组合进行了30个实验。用二阶回归方程（式2）描述了酵母抽提物、醋酸铵、谷氨酸钠和柠檬酸钠初始值的函数关系。根据模拟结果，响应面可由以下方程（式2）预测：

其中Y表示胞外氨酸产生量，X1、X2、X3和X4分别是酵母提取物、醋酸铵、谷氨酸钠和柠檬酸钠浓度的编码值。“Probgt;F”值小于0.05的模型项被认为是显著的，而大于0.10的则被认为是不显著的。在目前的模型中，四个线性项中的三个（X2、X3和X4）和所有平方模型项（X12、X22、X32和X42）对胞外激素的产生具有重要意义。外用药物生产的测定系数（R2）计算为0.966（R2gt;0.75表示模型的适用性），这表明模型可以解释高达96.6%的反应变异性。通过绘制任意两个自变量的三维响应面曲线，同时将其他变量保持在各自的“0”水平，来检验这些变量的最佳水平及其相互作用对体外素产生的影响。图3A-F所示为酵母抽提物与醋酸铵、酵母抽提物与谷氨酸钠、酵母抽提物与柠檬酸钠、醋酸铵与谷氨酸钠、醋酸铵与柠檬酸钠、谷氨酸钠与柠檬酸钠之间相互作用的三维响应曲线，分别是。响应面模型方程预测结果表明，酵母抽提液浓度为56g/L，醋酸铵浓度为14g/L，谷氨酸钠浓度为74.4g/L，枸橼酸钠浓度为6.2g/L时，胞外碱的最高产量为3.47g/L，明显高于对照值（0.6g/L），说明RSM设计策略确实显著提高了胞外碱的产量。优化培养基组成的验证实验也表明，胞外碱的产率为3.52g/L，与模型预测相吻合。关于碳源，根据文献，酵母提取物通常用于提供培养嗜盐或耐盐细菌所需的营养。此外，有报道证实酵母提取物有助于体外生成，与我们之前的工作一样，其中酵母抽提培养基与Marinococcus sp.ECT1的高细胞浓度和高四氢嘧啶产生有关。先前的研究也证实乙酸氨促进四氢嘧啶产生可能是由于其结构，即天冬氨酸的部分结构。天冬氨酸是胞外氨酸生物合成的前体。此外，文献还揭示了几种氨基酸可以促进胞外氨酸的产生。相应地，谷氨酸钠和柠檬酸钠也有利于胞外氨酸的产生。

4.2 溶氧对体外培养生产外源蛋白的影响

为了实现大规模生产，扩大生物产品的规模是很重要的。使用生物反应器来实现这一目标将涉及几个挑战，如控制溶解氧、搅拌行为和剪切力。这类问题的出现是因为生物反应器中产生的产物比烧瓶中产生的产物更多。在这些因素中，通过调节搅拌速率和纯氧来控制溶解氧的数量是非常重要的，因为使用微生物生产外啡肽需要消耗大量溶解氧，采用5L发酵罐扩大了海洋球菌MAR2胞外碱的生产规模。

如图4所示，当搅拌速率增加时，培养10h的marinoccus sp.MAR2的溶解氧随着pH值下降到7而下降，同时细胞生长和胞外蛋白的产生也增加。培养15h时pH值停止下降，开始升高，20h时细胞生长下降，25h时胞外碱产量达到3g/L，30h时缓慢增加到3.3g/L，24小时后胞外碱含量达到11%，但前期含量较低。结果表明，marinoccussp.MAR2菌株生产外源蛋白的条件也可应用于大规模生产。

介绍了纯氧与搅拌溶解氧的效果比较。如图5所示，实验结果与搅拌速率的实验结果基本一致。培养初期pH值逐渐降低，15h后缓慢升高。另外，随着pH值的升高，细胞生长和胞外激素的产生均增加。当发酵时间缩短到28h时，胞外碱产量达到3.3g/L。

随着pH值的升高，细胞生长和胞外质产生增加，说明底物被微生物所占据。因此，采用搅拌速率控制溶解氧有助于降低纯氧的使用成本。Schiraldi等人。报告的溶解氧含量可以导致羟考酮的快速积累，而不是羟考酮。此外，报告还证明，溶解氧的量可能改变pH值，从而进一步影响羟考酮的生产。

4.3 酵母抽提物投喂对体外培养的影响

根据图4和5，我们设计了一种基于pH值行为的补料分批培养策略，即先降低后升高。如图6所示，在进料分批培养中，pH值也显示出类似的趋势（即先降低后升高）。当pH值在17h上升到7.5左右时，我们引入2n硫酸来维持pH值。在pH值控制过程中，将200g/L酵母抽提液缓慢注入生物反应器，在23h时可获得3.3g/L的胞外碱产量。发酵时间比之前的结果（5-7小时）短得多（图4和5）

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