谷氨酸棒状杆菌的本源启动子及其在L-赖氨酸生产中的应用外文翻译资料

 2022-08-07 02:08

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谷氨酸棒状杆菌的本源启动子及其在L-赖氨酸生产中的应用

摘要

目的：鉴定有用的谷氨酸棒状杆菌本源启动子，用于调控代谢工程中的基因表达。

结果：鉴定了16个谷氨酸棒杆菌的本源启动子。这些启动子使用beta;-半乳糖苷酶作为报告基因，在31倍的强度范围内，以较小的增量增长，并且在整个生长阶段均表现出相对稳定的活性。在这些启动子的控制下，lacZ报告基因的mRNA水平和酶促活性表现出高度相关性（Rsup2;=0.96）。序列分析发现，强启动子的-10区六聚体与共有序列有高度的相似性，并且在-35区上游具有富含AT的UP元件。为了测试启动子库的实用性，用特征化的本源启动子来调节sucCD编码的琥珀酰辅酶A合成酶的表达，以提高L-赖氨酸的产量。

结论：在谷氨酸棒状杆菌的代谢工程中，具有各种优势的本源启动子可实现对基因表达高效、精确的调控。

关键词：谷氨酸棒杆菌 基因表达 L-赖氨酸生产 代谢工程 本源启动子 启动子

介绍

谷氨酸棒状杆菌是一种非致病性、无芽孢的革兰氏阳性细菌，通常被认为是一种安全的(GRAS)有机体，用于生物基化学品的工业生产，如氨基酸、核苷酸等(Becker and Wittmann 2015)。包括各种质粒，启动子和其他调控元件在内的遗传工具对于研究生理特性和改善工业菌株的性能是必不可少的（Nesvera和Patek 2011；赵等人，2016）。一些定义明确的诱导启动子，如来自大肠杆菌的Ptac和ParaBAD，已被广泛用于调节谷氨酸棒状杆菌的基因表达(张等人，2012)。然而，由于调控机制的不同和诱导剂的低通透性，它们无法表现出最优活性(Yim et .2013)。此外，通过随机突变构建了两个合成启动子库来调控基因表达(Rytter等人2014;Yim等，2013)。

与合成启动子相比，本源启动子在谷氨酸代谢工程中更易获取且效率更高。编码超氧化物歧化酶的sod基因和编码翻译延伸因子的tuf基因的两种强启动子已被广泛用于增强L-赖氨酸过量产生的关键基因的表达(Becker等，2011)。此外，在L-赖氨酸生产的代谢工程中，具有良好特征的本源启动子PdapA突变体已被用于调节柠檬酸合成酶通量(Ooyen等人.2012)。尽管已鉴定和分析了谷氨酸棒杆菌中的许多本源启动子序列（Patek和Nesvera 2011），但是这些启动子的未知转录活性使其无法用于代谢工程。

在这项研究中，对16个谷氨酸棒状杆菌本源启动子进行了鉴定。这些启动子在整个生长期表现出广泛的强度和相对稳定的活性，促进了基因表达的调整。这些启动子的序列特征与它们的强弱有关。为了检测本源启动子的潜力，我们使用了两个低强度启动子来调节sucCD基因的表达，成功地提高了L-赖氨酸的产量。

材料和方法

菌株，质粒和生长条件

在这项研究中使用的细菌菌株和质粒列于补充表1。 采用大肠杆菌EC135菌株进行基因克隆。分别在30 ℃和37 ℃的液体LB中培养谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌。当需要时，在培养基中加入20 mu;g氯霉素ml-1用于大肠杆菌，10 mu;g 氯霉素ml-1用于谷氨酸棒状杆菌；在培养基中加入50 mu;g 卡那霉素ml-1用于大肠杆菌，25 mu;g卡那霉素ml-1 用于谷氨酸棒状杆菌。对于L-赖氨酸的生产，在含有葡萄糖（每升）的复合培养基中生长8小时；20 g 葡萄糖、5 g (NH4)2SO4、2 g 尿素、5g 酵母提取物（酵母粉）、5g 胰蛋白胨、1.6 g K2HPO4、0.4 g MgSO4·7H2O、10 g SO4·7H2O、10 g MnSO4·H2O、1 g ZnSO4·7H2O、0.1 g CuSO4·5H2O、0.4 mg 硫胺素和50 mu;g 生物素，然后接种到30 ml发酵培养基中，其中（每升）：40 g 葡萄糖、2 g 酵母提取物、15 g (NH4)2SO4、2.5 g KH2PO4、0.4 g MgSO4·7H2O、10 mg FeSO4·7H2O、10 mg MnSO4·4H2O、1 mg ZnSO4·7H2O、0.1 mg CuSO4·5H2O、200 g 硫胺素和100 mu;g 生物素在500ml挡板摇瓶到最终OD600为1。发酵48h,在发酵过程中，当剩余葡萄糖浓度低于10g葡萄糖L-1时，从600g 葡萄糖L-1原液中添加葡萄糖，并加入NH4·OH以保持pH在7。

质粒和菌株的构建

采用基因组分离试剂盒、明胶提取试剂盒和质粒分离试剂盒分别提取DNA、PCR产物和质粒DNA。这项研究中使用的所有引物都列在补充表2中。使用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板，扩增了谷氨酸棒杆菌的本源启动子。从大肠杆菌W3110中扩增lacZ（beta;-半乳糖苷酶）基因的整个开放阅读框，并与通过限制酶去除了tac启动子和阻遏物区域的pXMJ19质粒连接，从而获得了启动子探针载体。将不同的启动子导入到启动子探针载体中，通过电转的方式将其转化到谷氨酸棒状杆菌中，通过同源重组质粒 pK18mobsacB 对谷氨酸棒状杆菌染色体进行修饰。为了获得赖氨酸生产菌株基因的过量表达，在异丙基-beta;-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子(Becker et al. 2011)的控制下，用Gibson（吉布森）组装，扩增了反馈抗性天门冬氨酸激酶(lysCC932t)、二氨基吡啶脱氢酶(ddh)和赖氨酸(lysA)基因，并将其连接到 pXMJ19表达盒中。将共识的RBS序列 AAAGGAGGA 插入 lysCC932t、ddh 和 lysA 的开放阅读框的前面，以增强它们的表达。将重组质粒转化到产生赖氨酸的菌株中，利用转化产生的菌株LYS-1进行启动子工程效果评价。所有的修饰都经过了PCR扩增和DNA测序。

beta;-半乳糖苷酶测定

用荧光底物4-甲基伞形基-D-吡喃半乳糖苷（MUG）测量beta;-半乳糖苷酶活性。谷氨酸棒状杆菌在液体LB中过夜生长，然后将40mu;l 培养物转移到96孔的微孔板上，微孔板上含有80mu;l Z-缓冲液（40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM beta;-巯基乙醇, pH 7.0）,通过测定OD595评估相应的细胞密度。

荧光定量PCR (qRT-PCR)

使用RNAprep Pure Cell /细菌试剂盒提取总RNA(天根，中国北京)，然后在-80℃保存直到使用。以目的基因的特异性引物，用FastQuant RT试剂盒(天根，北京，中国)进行逆转录。采用来自GoTaq qPCR主混合液(Promega, USA)的BRYT Green，通过LightCycler 96 Real-Time PCR System (Roche, Switzerland)进行定量PCR。以谷氨酸棒状杆菌的rpoB基因为参考基因。进行阴性对照以排除DNA和其他污染物。通过熔解曲线分析验证了qPCR产物的特异性。使用LightCycler 96软件进行数据分析。

通量平衡分析

基于Cobra Toolbox 2.05和MatLab 2014a，利用LP求解器GLPK，构建了谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组尺度代谢模型iCW773，该模型能够准确预测不同生长条件下培养细胞的通量分布(张等人。2017)。在通量平衡分析(FBA)中，分别以细胞生长和赖氨酸产量为目标函数，计算了4 mmol葡萄糖g DCW -1h-1的固定葡萄糖摄取率的表型。为了研究琥珀酰辅酶A合成酶(SUCOAS)通量对赖氨酸产量和细胞生长的影响，使用相对SUCOAS通量用FBA进行稳健性分析。

图 1 lacZ报告基因beta;-半乳糖苷酶活性的启动子强度分析。a、b含不同启动子-探针载体的谷氨酸棒状杆菌的生长。6h、12h、24h收集c细胞，进行beta;-半乳糖苷酶活性测定。以Ptacb为对照。误差条表示生物三副本的标准偏差

结果：

谷氨酸棒状杆菌本源启动子强度的评估

为了拓展基因表达微调的工具，筛选谷氨酸棒状杆菌染色体中参与中心碳代谢和氨基酸代谢的启动子，以分析它们的优势。用常用的本源启动子Ptuf和 Psod进行活性评价，并以杂交启动子Ptac作为对照。选取16个基因的翻译起始位点上游200 bp的序列，扩增并连接到以lacZ为报告基因的启动子探针载体上，其中包含启动子全长和50个非翻译区。通过测定谷氨酸棒状杆菌beta;-半乳糖苷酶的活性来评价这些启动子的活性。

为检测启动子的稳定性，分别于6 h、12 h和24 h培养并检测细胞分别对应生长中期、生长后期和稳定期(图1a、b)。从beta;-半乳糖酶活性的测定中可以看出，启动子活性范围很广。大多数启动子在整个培养过程中都表现出相对稳定的活性，即Ppgk等启动子在H组不同生长期均表现出较高的beta;-半乳糖苷酶活性，而L组启动子仅表现出较低的beta;-半乳糖苷酶活性(图1c)。

启动子的转录分析

为了准确评价这些启动子的活性，采用qRT-PCR方法分析了不同启动子控制下lacZ的相对mRNA水平，并将其归一化为Ptac控制下的相对mRNA水平。lacZ基因的mRNA水平分布在33倍范围内，大多数启动子转录水平的强弱顺序与beta;-半乳糖苷酶活性的强弱顺序一致(图 2a)。beta;-半乳糖苷酶活性与转录水平的相关矩阵呈线性相关(Rsup2;= 0.96)(图2b)，表明报告基因在转录水平上可以被代表性启动子精确调控。

图 2 qRT-PCR对启动子强度的评价。不同启动子控制下的lacZ报告基因的转录水平。beta;-半乳糖苷酶活性与lacZ报告基因mRNA水平的相关性。误差条表示生物三副本的标准偏差。

lacZ基因的mRNA水平分布在33倍范围内，大多数启动子转录水平的强弱顺序与beta;-半乳糖苷酶活性的强弱顺序一致(图 2a)。beta;-半乳糖苷酶活性与转录水平的相关矩阵呈线性相关(Rsup2;=0.96)(图 2b)，表明报告基因在转录水平上可以由具有代表性启动子精确调控。

谷氨酸棒状杆菌本源启动子的序列分析

由于所选启动子的所有转录起始位点（TSS）和核心区域均可用（Mentz等人2013; Patek和Nesvera 2011），因此TSS上游序列（包括-10和-35）进行了比对。 保守的六聚体TANANT在-10区发现，而-35区的序列在16个启动子中保守性低得多（Crooks等，2004；Patek和Nesvera 2011）。此外，在-10区六聚体上下游的二核苷酸在16个启动子中的保守性相对较低（在图1被补充）。为了研究序列特征与启动子H-基因组和L-基因组强度之间的关系，利用WebLogo软件对这些启动子关键基因进行对齐，比较启动子不同位置上每个核苷酸的丰度。H-基因组启动子的-10核心区域与谷氨酸棒状杆菌启动子中最保守的TATAAT六聚体高度相似。与L-基因组启动子相比，-35区域的TTG在H-基因组启动子中丰度更高。此外，位于-35区上游的AT富集元件在H-基因组启动子上更多(图 3)。

图 3使用Weblogo软件对9个强启动子和6个弱启动子进行序列标识。a,b分别是强启动子和弱启动子的-10区域的序列标识。c,d分别为强启动子和弱启动子的-35区的序列标识。-10区域和-35区域用灰色框标记，-35区域上游的UP元件用虚线框标记。

通过调节启动子活性提

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