多粘芽孢杆菌NSY50通过调节根际微生物群落抑制黄瓜枯萎病外文翻译资料

 2022-08-08 10:08

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多粘芽孢杆菌NSY50通过调节根际微生物群落抑制黄瓜枯萎病

卢石1,*，南山杜1,*，圣树1,2，金孙1,2，李书展1 和郭世荣1,2

从醋渣基质中分离出来的多粘芽孢杆菌（P. polymyxa）NSY50，抑制黄瓜根际中尖孢镰刀菌的生长，并保护宿主植物免受病原体入侵。本研究的目的是评估暴露后施用NSY50对黄瓜生长，土壤特性和根际土壤微生物群落组成的影响。

尖孢镰刀菌。通过Illumina对16S rRNA基因和内部转录间隔区（ITS1）和ITS2（ITS1）进行测序，研究了细菌和真菌群落。结果表明，NSY50通过改变土壤的理化特性（例如pH，土壤微生物量碳，土壤微生物量氮，总氮和有机碳）和酶活性，有效降低了枯萎病的发生率56.4％。特别是脲酶beta;-葡萄糖苷酶和beta;-葡萄糖苷酶相对于病原体治疗条件分别显着增加了2.25和2.64倍。更具体地说，NSY50的施用减少了镰刀菌的丰度并促进了潜在有益的群体，包括芽孢杆菌，放线菌，链霉菌，放线菌，Catenulispora和假单胞菌属。因此，我们的结果表明施用NSY50可以改善土壤特性，通过增加有益菌株并减少黄瓜根际中的病原菌定植来改变微生物群落，并减少黄瓜枯萎病的发生，从而促进黄瓜的生长。

黄瓜枯萎病，由尖孢镰刀菌引起Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum (FOC)是一种典型的土传真菌病，导致黄瓜减产和重大经济损失。镰刀菌枯萎病的症状是叶子变黄和坏死，然后是叶萎wil和根部暗褐色变色，甚至随着病原体侵入黄瓜的血管系统而使整个植物死亡。植物死亡通常在几天或几周内发生。已建议使用传统的管理方法来控制枯萎病，包括使用抗性品种，嫁接秧苗，轮作和化学策略，但这些方法不经济，可靠或对环境不友好。

迄今为止，生物防治已被认为是对抗枯萎病的有效和可持续的方法。根际细菌和真菌的某些菌株（称为生物防治剂（BCA））可以保护植物免受土壤传播的病原体侵害并改善植物的生长，这已被广泛接受。在BCA中，报道最多的细菌属是假单胞菌（Pseudomonas spp）和芽孢杆菌属。已经显示出作为针对不同真菌病原体的BCA的潜力。 BCA可以抑制疾病并提高作物产量

图1.不同处理的效果（CK，未处理的植物（对照）； NSY50，受到NSY50攻击的植物（2.5times;108CFU / mL）； FOC，受到FOC攻击的植物（1times;108CFU / mL）； NSY50 FOC：用NSY50攻击3天，然后用FOC攻击的植物，其枯萎病的发生率（a），各种生长指数，包括身高（b），鲜重（c）和FOC接种30天后的“金春2号”黄瓜幼苗的干重（d））。

受到抗菌素，养分和生物生态位竞争，严重的寄生虫病和抗药性的诱导的影响。近年来，链霉菌CT205被鉴定为抑制黄瓜植物枯萎病的潜在生物防治剂。阿卜杜拉（Abdallah）等人还发现暴露于芽孢杆菌属后，枯萎病的严重程度显着降低。海峡病原体受到挑战的番茄植株中的SV101和SV104。在另一项研究中多粘芽孢杆菌菌株可引起抗菌作用并产生多粘菌素，粘菌素和水解酶，在植物病原体的生物防治中起着重要作用。此外，根际微生物群落是决定植物健康的主要因素，并且对于维持健康和稳定的微环境至关重要的生物，化学和物理过程也非常重要，并成功地抑制各种疾病。反过来，土壤酶活性，植物种类和土壤类型也会影响微生物群落的组成，从而有助于抑制植物病害。

微生物的多样性可以通过常规的分离培养物和平板计数，磷脂脂肪酸（PLFA）分析以及变性梯度凝胶电泳（DGGE）进行评估。但是，基于培养的方法很耗时，使用这些方法无法实现鉴定更多微生物所需的测序深度。最近，Miseq测序平台的 PE300已被用作下一代测序（NGS）方法，用于深入分析土壤微生物群落结构。 16S rRNA基因和内部转录间隔区（ITS）区域现已广泛用于分析土壤细菌和真菌群落。这种方法提供了对生态过程和土壤微生物群落的见解。据我们所知，尚未通过高通量测序评估了受到多粘黏液霉NSY50攻击的黄瓜的微生物群落。

聚粘毕赤霉菌NSY50最初是从醋残渣底物（VRS）中分离出来的。 VRS是一种新颖的有机物，是醋业生产的园艺基质。在我们之前的研究中，VRS被证明可以有效控制黄瓜枯萎病。另外，双重培养拮抗生物测定法显示NSY50具有广谱抗性。因此，本研究的目的是（1）评估NSY50对黄瓜中FOC抑制的影响，（2）使用Illumina测序技术比较NSY50和FOC攻击后根际微生物群落组成的差异。（3）进一步说明土壤传播疾病的抑制机制。

结果

疾病发病率和植物生长。研究了NSY50接种对黄瓜植株抑病和植物生长的影响。（如图。1）。接种病原菌后，用FOC处理后，黄瓜植株出现了疾病症状，包括较高的叶黄和木炭腐烂（如图。2). 疾病发生率达到81.25％。但是，使用NSY50进行预处理的效果显着少了疾病的发生，黄瓜叶中的黄变较少。另外，工厂高度（如图。1b），鲜重（如图。1c）和干重（图1d）所有这些对NSY50处理均呈阳性反应，接种NSY50可以增强黄瓜的生长。与对照处理（CK）相比，NSY50处理显着提高了株高33.62％，鲜重36.45％，干重39.42％。此外，与仅使用FOC种植的黄瓜相比，使用NSY50 FOC种植的黄瓜的生长指数显着增加。

图2.不同处理后的症状发生（CK，未处理的植物（对照）； NSY50，被NSY50攻击的植物（2.5times;108CFU / mL）； FOC，被FOC攻击的植物（1times;108CFU / mL）； NSY50 FOC：在接种FOC后第30天，用NSY50攻击3天，然后用FOC攻击黄瓜生长的植物。图片代表两个独立的生物学实验。

土壤理化性质和酶活性。为了确定NSY50是否能有效改变土壤理化性质并产生更好的条件，我们测试了pH，Corg，Cmic，Cmic/ Corg，Rmic，qCO（2，总P和总N。桌子如图1所示，在NSY50处理后，Corg 和Cmic 增加最多，其值分别比对照处理（CK）高出16.95％和23.91％。此外，与NSY50 FOC处理相比，FOC处理显着提高了qCO2 的含量，但降低了Corg ，Cmic ，Cmic / Corg ，Rmic ，总磷和总氮。降幅最大的是Cmic ，下降了33.50％。

在这项研究中，我们评估了7种土壤酶的活性，包括过氧化氢酶，转化酶，脲酶，蛋白酶，磷酸酶，beta;-葡萄糖苷酶和FDA水解酶（表2）。在包括用NSY50攻击的治疗中，这7种酶的活性均有不同程度的提高。具体而言，与对照治疗（CK）相比，NSY50的施用显着增加了尿素酶，磷酸酶和beta;-葡萄糖苷酶的活性，

分别为115.39％，73.65％和161.22％。而且，与单独的FOC处理相比，NSY50 FOC处理刺激了脲酶和beta;-葡萄糖苷酶的活性为2.25和2.64倍。

当利用土壤的理化特性来限制RDA中所有7种酶的活性排序时，该模型占总变化的98％。根据蒙特卡罗置换试验，模型中保留的所有解释变量在限制酶活性方面均具有显着意义（P lt;0.05）。如图所示在测得的土壤理化因子中，CMIC，总氮和CORG 的含量均与磷酸酶，过氧化氢酶，蛋白酶和FDA的水解活性有关。沿轴1的所有酶活性均与Corg 正相关，Corg 与该轴的相关性高于任何其他变量，如其载体的长度和方向所示。另外，beta;-葡萄糖苷酶的活性与Corg 高度相关。

测序结果和微生物多样性分析。在这项研究中，经过质量过滤后，基于llumina测序的土壤样品分析产生了432,941个16S rRNA基因序列和452,333个真菌ITS序列，这些序列是从12个根际土壤样品中获得的，每个土壤样品中细菌的平均序列为36,078plusmn;2260个每个真菌土壤样本有37,694plusmn;2531个序列。基于读数之间97％的核苷酸序列同一性，共鉴定出细菌的1634个操作分类单位（OTU）和真菌的365个OTU（请参见补充图S1）。在3％的不相似水平下对土壤样品进行的Rarefaction曲线分析表明，曲线开始趋于平稳，这表明采样是足够且合理的。

此外，我们估算了社区丰富度的Chao 1和ACE指数，以及社区多样性的Shannon指数。结果表明，NSY50 FOC处理过的土壤中细菌的Chao 1值以及ACE和Shannon指数显着高于FOC处理过的土壤。但是，对于真菌，Chao 1和ACE指数显示相反的结果。

社区结构和PCA分析。使用非加权UniFrac算法计算的层次聚类分析表明，从接受相同处理的土壤中收集的细菌和真菌的群落结构聚在一起。用NSY50预处理的土壤和土壤

用FOC处理后显然彼此分开。此外，PCA显示四种治疗对社区的影响不同 （参见补充图S2）。在数据集的总方差中，前两个主要成分分别解释了总细菌和真菌群落的75.46％和98.14％。在细菌中，第一主要成分（PC1）最重要，占总变异的58.26％。社区结构可能在很大程度上负责这些变化。总体而言，PERMANOVA显示所有OTU根据治疗情况均存在显着差异（细菌，R2= 0.6403，P = 0.001；真菌，R2= 0.9536，P = 0.001）。

NSY50攻击对土壤微生物群落组成的影响。在门的水平上，在不同处理的样品中鉴定出11种细菌和3种真菌门。在我们的样本中检测到了Firmicutes门，但它不是如图所示的最丰富的细菌门。从所有样本中获得的大多数序列都属于分类细菌菌群，属于Proteobacteria，Acidobacteria和Gemmatimonadetes。。与FOC条件相比，NSY50 FOC条件下糖菌和放线菌的丰度显着增加。接种植物后（FOC和NSY50 FOC），酸性细菌的相对丰度增加，占总种群的20％。分类的真菌门系，未分类的真菌在不同处理中占据了很大比例，特别是在对照和NSY50处理的土壤中。可能与所用的基材有关，在我们的盆栽试验中，我们使用了混合的基材。但是，FOC挑战影响了真菌的组成，降低了未分类真菌的比例。在鉴定了子囊菌，担子菌和球菌。有趣的是，NSY50处理后，担子菌和球菌的丰度显着增加。在FOC条件下，子囊菌的相对丰度最高，接近80％。

在属水平前80个分类细菌属的相对丰度分析而使用分层热图的前20个分类真菌属显示FOC和NSY50挑战性治疗的显着差异。在排名前80位的细菌属中（参见补充图S3），以前已经鉴定出许多BCA。我们选择了6个BCA作为代表，包括芽孢杆菌，放线菌，链霉菌，放线菌，Catenulispora和假单胞菌。与FOC处理相比，NSY50处理显着丰富了BCA的相对丰度。排名前20位的真菌属的相对丰度与细菌属相比，没有充分富集。有趣的是，只有镰刀菌在FOC和NSY50 FOC条件下代表丰富的属。此外，与FOC处理相比，NSY50预处理（NSY50 FOC）显着降低了镰刀菌的丰度，从而导致黄瓜枯萎。然而，与NSY50相关的青霉丰富，因为在物种水平上，未分类的青霉菌在NSY50中占据了很大的比例（参见补充表S2）。

土壤环境变量与丰富植物群落之间的相关性。微生物区系的组成与土壤的整体生态环境密切相关。

例如土壤酶的活性和理化特性会影响土壤微生物和生态系统功能，并且可以通过操作来最佳地抑制枯萎病。分析了基于门的相关性（如图。8).

RDA分析表明，完整的RDA模型占细菌总变异的75.5％。第一成分（RDA1）解释了细菌菌群总变异的58.3％，而第二成分（RDA2）解释了17.2％。 NSY50细菌群落与较高的土壤pH，Cmic，Rmic，总氮，Corg 和Cmic/ Corg 相关，并且与FOC处理相关的细菌群落高度相关与qCO2 和疾病有关。在NSY50和NSY50 FOC条件下，所有土壤酶活性均对土壤细菌群落有显着影响。此外，门志Gemmatimonadetes，放线菌，糖细菌和Firmicutes与酶活性和N的总含量密切相关，Corg，Cmic 和Rmic 。对于真菌门（如图。8b），RDA的前两个轴分别解释了66.1％和32.1％

讨论

根际微生物组在不同条件下的多样性以及对土壤环境变化的响应都不同。此外，它们对于控制植物病害以及因此对植物健康至关重要。然而，根际微生物组如何调节疾病抑制仍然是一个悬而未决的问题。在这项研究中，我们评估了NSY50激发对抑制黄瓜枯萎病的积极作用。以前的许多发现表明，添加BCA可以有效控制土壤传播的疾病，尤其是枯萎病，并可能导致广泛的抑制作用。此外，一旦受到真菌根病原体的侵袭，

植物可以动员其独特的根际微生物种群进行保护。因此，我们在Miseq平台上使用Illumina测序（16S rRNA基因和ITS区域）探索了土壤微生物群落对NSY50应用的响应。

我们的研究提供了关于NSY50挑战如何影响底物的理化特性，酶活性和根际微生物组抑制黄瓜枯萎病的变化的见解。这两个假设通过以下方式得到支持。首先，许多其他报告表明，当植物受到病原体侵袭时，它们可以改变其特定的根际群落。因此，在我们的研究中，NSY50挑战可能对根际细菌和真菌群落具有选择性作用，从而改变了底物环境的各个方面。其次，接种FOC导致许多FOC种群在根际定居，这可能会改变根际群落的组成。尽管FOC人群包括致病性和非致病性FOC，但无法单独量化42。在我们的研究中，盆栽试验的结果和较高的发病率表明，致病性FOC是在根际土壤中测定的FOC的主要成分。

在盆栽试验中，NSY50的施用对黄瓜植株的生长有积极的影响。与CK处理相比，株高，鲜重和干重均有不同程度的增加。此外，该病的发病率得到了显着抑制，这表明NSY50具有刺激植物生长和抑制土壤传播病原体的能力。这些结果与其他报道一起证明

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