水飞蓟宾纳米粒的制备及表征外文翻译资料

 2022-05-30 10:05

据报道水飞蓟宾具有多种生物活性。然而，其疏水性限制了其生物利用度，从而影响体内生物活性。基于纳米颗粒的这类分子递送已经成为解决这些问题的新技术。最近，壳聚糖的生物可降解，相容性和粘附性吸引了其作为生物活性分子载体的适用性。本研究提出了基于壳聚糖 - 三聚磷酸盐的水飞蓟宾包封的制备和表征。研究了水飞蓟宾包封的壳聚糖 - 三聚磷酸盐纳米颗粒的各种制备物的粒径，形态，zeta;电位和包封效率。还对制剂的体外细胞毒活性进行了评估。优化的水飞蓟宾负载壳聚糖纳米粒子粒径为263.7plusmn;4.1 nm，zeta电位为37.4plusmn;1.57 mV。纳米颗粒显示高水飞蓟宾包封率（82.94plusmn;1.82％）。在FTIR分析中没有观察到水飞蓟宾和壳聚糖之间的化学相互作用。粉末X射线衍射分析显示包封后水飞蓟宾的转化物理状态。使用TEM和DSC分析确定表面形态和热行为。包被的水飞蓟宾显示出比单独水飞蓟宾增加的溶解和对人前列腺癌细胞（DU145）的更好的细胞毒性。

1.简介

水飞蓟宾（SLB）是一种多酚黄酮，是水飞蓟素中的主要生物活性成分，其来源于奶蓟植物，水飞蓟的种子。它广泛用于治疗各种急性和慢性肝毒性，炎症，纤维化和氧化应激。各种研究表明SLB对乳腺癌，肺癌，结肠癌，脑癌和前列腺癌等不同癌症也有活性。 SLB通过细胞周期调控，细胞凋亡诱导，化学增敏，生长抑制，抗炎，抑制血管生成，逆转多药耐药和抑制侵袭和转移显示出抗增殖活性。庞大的多环结构和较差的口服生物利用度（23-47％）的SLB导致其低水溶性，因此其临床作用是有限的。纳米药物递送系统如纳米颗粒，纳米胶束，纳米混悬剂和纳米乳剂具有以改进方式递送疏水性药物的巨大潜力。已经采用许多方法来提高SLB的功效和生物利用度，例如水飞蓟宾 - 磷脂复合物，树枝状聚合物，纳米悬浮液，水飞蓟宾纳米结构脂质载体，水飞蓟宾水凝胶和自乳化药物递送系统。可生物降解的聚合物纳米粒子已经吸引了很多注意力来克服药物相关问题壳聚糖是通过脱乙酰几丁质衍生的天然存在的阳离子多糖。基于壳聚糖的制剂已经用于递送药物活性成分，核酸，蛋白质治疗剂和抗原。由于生物相容性，生物可降解性，无毒性，非免疫原性和非致癌性，壳聚糖被广泛用于制备纳米颗粒。由于壳聚糖的粘膜粘附和渗透促进特性，其纳米粒子是口服药物递送的非常有前景的载体。壳聚糖TPP纳米粒子以前用于包封各种天然化合物如芦丁，槲皮素，茶儿茶素，姜黄素和抗坏血酸。壳聚糖纳米粒子通常通过使用交联剂如戊二醛，三聚磷酸酯和聚天冬氨酸来制备。本研究的目的是制造用于口服递送的水飞蓟宾包封的壳聚糖-TPP纳米颗粒并评估包封的SLB用于抗癌活性的潜力。使用动态光散射（DLS），透射电子显微镜（TEM），傅里叶变换红外光谱（FTIR），差示扫描量热法（DSC）和粉末X射线衍射（XRD）技术对纳米颗粒进行各种物理化学性质表征。

2.材料与方法

水飞蓟宾，壳聚糖和三聚磷酸钠（TPP）购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）。 Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），胰蛋白酶-EDTA，抗生素抗真菌溶液，MTT [3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑]，二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma Chemicals Co.（美国密苏里州圣路易斯）。 胎牛血清（FBS）购自Gibco，USA。 细胞培养96孔板和塑料制品从Techno塑料制品（CH-8219 Trasadingen，Switzerland）获得。 所有其他化学品都是分析级。

2.1 水飞蓟宾负载壳聚糖纳米粒子（SCN）的制备

壳聚糖纳米粒子通过离子胶凝法制备，不同比例的壳聚糖和TPP（表1）。 将壳聚糖溶于1％乙酸溶液中并将pH调节至4.8。 将SLB溶解在丙酮中并在持续搅拌下滴加到壳聚糖溶液中，然后使用探针超声波仪（Vibra Sonics，Biotech-North America）以65％的振幅超声处理2分钟。 在上述溶液中逐滴加入TPP溶液并进一步在500rpm下搅拌3小时。 纳米颗粒悬浮液以15,000rpm离心30分钟。 除去上清液并用蒸馏水洗涤纳米颗粒两次。 使用（Modulyod-230，Thermo电子冷冻干燥器，美国）使用海藻糖（5％，w / v）作为冷冻保护剂冻干纳米颗粒。 仪器设定在-50℃，真空压力小于1毫巴。 制备不含SLB的空白壳聚糖纳米颗粒（BCN）。

2.2。纳米粒子的物理化学表征

2.2.1。粒径和zeta;电位

通过使用Zetasizer，Nano-ZS（Malvern Instruments，UK）对空白和负载SLB的纳米粒子进行粒径，多分散指数（PDI）和zeta;电位的表征。在分析之前，纳米粒子分散体用蒸馏水稀释。

2.2.2。透射电子显微镜（TEM）

通过TEM分析检查SCN的表面形态。将纳米粒子分散在蒸馏水中，并将一滴悬浮液浇铸到铜网上。通过滤纸除去额外的溶液，风干并在室温下在透射电子显微镜（FEI Tecnai，G112，Philips，USA）下直接观察，无需染色。

2.2.3。傅里叶变换红外（FTIR）分析

采用溴化钾颗粒法对SLB，壳聚糖和SCN进行FTIR分析。将样品与溴化钾混合，压缩成粒料并使用FTIR分光光度计（Perkin Elmer，Spectrum One，UK）在4000-450cm -1范围内扫描百分比透射率。

2.2.4。差示扫描量热法（DSC）

SLB，BCN和SCN的热行为通过使用DSC（EXSTAR DSC7020，日本）进行。样品在惰性氮气氛下以密封铝盘加热，扫描速率为10℃/分钟，从50℃到250℃。使用空铝盘作为参考。

2.2.5。粉末X射线衍射研究（PXRD）

SLB，BCN和SCN的X射线衍射图通过使用具有在45kV和20mA产生的Cu K辐射的Siemens D-5000X-射线衍射仪（德国）获得。衍射图在2°至60°的范围内运行，以0.013°的步长持续13.6秒。

2.3.Silibinin包封率

包封率（EE）采用间接法计算。 将SCN以15,000rpm离心30分钟。 收集上清液并通过使用UV / VIS分光光度计（Perkin Elmer，Lambda 25，UK）在287nm处分析水飞蓟宾含量。 ％EE计算如下：

2.4。 溶出度研究

通过使用溶解测试台USP设备-2（桨式）（SR8 plus，Hanson Research，USA）进行纯SLB和SCN的溶解研究。 研究在两种缓冲介质中进行，即模拟胃液（pH 1.2）和磷酸盐缓冲液（pH 6.8）。 将900ml体积的缓冲溶液置于溶解瓶中并保持在37plusmn;0.5℃的恒定温度下。 将该装置设定为100rpm的速度，并将10mg SLB或SCN（相当于10mg SLB）加入到各个溶解瓶中。 以预定的时间间隔抽取5ml样品的等分试样并加入等体积的新鲜缓冲液以保持沉降条件。 样品中的水飞蓟宾浓度通过UV / VIS分光光度计在287nm处针对缓冲溶液测定。

2.5。 细胞培养和测试样品的制备

人前列腺癌细胞系（DU-145）获自美国典型培养物保藏中心（ATCC）（Manassas，VA，USA）。 细胞在补充有10％FBS，0.3％碳酸氢钠，10ml / L抗生素抗真菌剂溶液（10,000U / ml青霉素，10mg / ml链霉素和25mu;g/ ml两性霉素B），1ml 2mM L-谷氨酰胺和1ml 100mM丙酮酸钠。 将培养物保持在37℃的CO2培养箱中，90％湿润气氛和5％CO2。 为了制备测试化合物的储备溶液，将纯SLB溶解在DMSO（1mg / ml）中，而将SCN分散在无菌PBS中。 用无菌PBS进行各种进一步的稀释以获得期望的浓度。 所有制剂用0.22mu;m无菌过滤器过滤并在使用前保持在UV辐射下20分钟。

2.6。细胞毒性研究（MTT测定）使用MTT测定评估不同SLB样品的细胞毒性。该测定基于MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成紫色甲crystals结晶，其溶解于DMSO中，并在570nm处测量吸光度。简而言之，将1times;104指数生长细胞（通过台盼蓝拒染法计数）接种到每个96孔板中并使其生长。在70％汇合时，用不同配方的空白纳米颗粒，纯水飞蓟宾和SCN以及对照（阴性和阳性）以5-200M的浓度处理细胞。 48小时后，用90mu;l新鲜无血清培养基和10mu;lMTT（PBS中5mg / ml）代替孔的培养基，并将平板在37℃再温育2小时。此后，丢弃培养基，将培养板干燥30分钟，并在每个孔中加入100mu;lDMSO以溶解紫色甲crystals结晶。使用Spectra Max plus 384 UV-可见平板读数器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）立即在570nm处读取样品的吸光度。 IC-50值由MS-excel的概率分析软件包确定。

2.7。稳定性研究为了测定SCN的物理和化学稳定性，配方在4℃储存至2个月。分析稳定性样品的粒径，zeta;电位，多分散指数和药物含量。

2.8。统计分析所有研究一式三份进行，数据以平均值plusmn;SD（标准偏差）表示。使用Student#39;s t检验分析两组的单因素方差分析和多组的单因素方差分析。p值lt;0.05被认为是有意义。

3.结果和讨论

3.1。水飞蓟宾负载壳聚糖纳米粒子（SCN）的制备

水飞蓟宾负载壳聚糖纳米粒子通过离子凝胶法制备。微乳液，乳化/溶剂扩散，聚电解质复合物和离子凝胶是制备壳聚糖纳米粒子的四种方法。离子胶凝法是基于带正电荷的壳聚糖和带负电荷的聚阴离子之间的静电相互作用。在该方法中，将壳聚糖溶解在1％（v / v）乙酸中，并逐滴添加TPP以允许自发形成纳米颗粒。通过改变壳聚糖与TPP的比例制备各种制剂（表1）。随着壳聚糖/ TPP比例从2：1增加到4：1，平均粒径从410.6nm减小到237.1nm。壳聚糖/ TPP比例的进一步增加导致由于沉淀造成的粒径增加。数据表明壳聚糖和TPP之间的最佳相互作用（分子间和分子内）发生在4：1的比例。壳聚糖与TPP之间的相互作用也受纳米颗粒表面电荷变化的支持。所有制剂（F1-F6）均显示阳性zeta;电位，表明存在未缀合的壳聚糖NH3 基团。随着壳聚糖/ TPP比例的增加，表面电荷也从23.8mV增加至44.7mV（F1-F4）。表面电荷的增加是由于壳聚糖-TPP复合物中存在更多游离的阳性胺基。令人惊讶的是，随着壳聚糖/ TPP比率增加（7：1，F5），zeta电位降低至36.5 mV，这可归因于高质量水平下壳聚糖分子的聚集或沉淀。总体而言，高zeta电位值表明纳米颗粒的高物理稳定性。通过测定上清液中的SLB含量来间接测量SLB的包封率。 EE被发现取决于聚合物含量。超过95％的SLB以高聚合物含量（SCN1和SCN2）包封。随着配方中SLB含量的增加，EE降低并且粒径显着增加。包封效率的下降可以用聚合物的量不足来解释。由于具有最佳粒度（263.7plusmn;4.1nm），低多分散性（0.243）和高zeta电位（37.4plusmn;1.57mV）的良好EE（82.94plusmn;1.82％），SCN3的配制被认为是最终最佳的。

3.2。纳米粒子的物理化学表征

表1报道了不同纳米粒子制剂的粒径，多分散指数（PDI）和zeta电位。空白（BCN）和水飞蓟宾负载纳米粒子（SCN）的平均粒径分别为237.1nm和263.7nm。发现SCN和BCN的PDI值均小于0.3，表明均匀的粒度分布。纳米粒子的正zeta电位可能归因于壳聚糖表面氨基的存在，数值越高表明纳米粒子的稳定性越好。通过TEM分析确定纳米颗粒的表面形态。图1显示纳米粒子呈球形并且均匀分散。在TEM分析中，粒度范围为100-150nm。为了研究水飞蓟宾和壳聚糖之间可能的化学相互作用，进行了FTIR分析（图2）。纯的壳聚糖FTIR光谱（曲线a）显示在3550（OH拉伸），1664（酰胺I），1605（NH 2弯曲），1392（酰胺III）和1147cm -1（CO拉伸）处的吸收带。水飞蓟宾的FTIR光谱（曲线b）在3457.13（OH伸缩振动），2946.77（CH伸缩），1630.40（CO伸缩），1508-1468（芳香族CC环拉伸的骨架振动），1269.95cm -1 COC拉伸）。物理混合物（曲线c）和水飞蓟宾负载的纳米颗粒（曲线d）的光谱没有显示来自水飞蓟宾光谱的峰位置的任何变化。结果显示水飞蓟宾和壳聚糖之间没有任何化学相互作用。进行DSC以检查包封前后水飞蓟宾的热行为和结晶度（图3）。水飞蓟宾的DSC热谱图显示在168.1℃时有明显的熔融吸热现象，而在93.2℃时观察到纯壳聚糖的吸热峰，这与其玻璃化转变温度相对应。载有水飞蓟宾的纳米颗粒没有与水飞蓟宾相关的热峰，表明水飞蓟宾是无定形的并均匀地分散在聚合物基质中。图4显示纯水飞蓟宾，壳聚糖和SCN的PXRD图。纯SLB的X射线衍射图显示在14.7°，16.1°，17°，19.3°，20.5°，21.2°和24.5°有明显的强烈峰，表明SLB的晶体性质。在SCN的情况下，衍射图显示衍射峰在相同的2值处完全消失，证实SLB本质上不是结晶的并且成功地包封在纳米颗粒中。

3.3。 溶出度研究

在0.1N HCl（pH1.2）和磷酸盐缓冲液pH6.8中分别进行溶解研究以模拟胃和肠pH条件。 发现纯水飞蓟宾在SGF中溶解3小时18.56％，在磷酸盐缓冲液中溶解38.07％达8小时（图5）。 纳米颗粒显示水飞蓟宾溶解度显着增加。 将约54.32％和82.4％的包囊水飞蓟宾分别溶于0.1N HCl和PB中。 水飞蓟宾在纳米颗粒中的溶解速度比纯SLB快，可归因于其无定形性质，较小的颗粒尺寸和较大的表面积。 以无定形形式存在的物质比晶体更易溶于水，因为从晶格转移分子所需的能量大于非晶或无定形固体所需的能量。 较小的颗粒尺寸增加了有效表面积并因此增加了分子的溶解度。

3.4。细胞毒性研究

水飞蓟宾已经通过各种机制显示出抗增殖作用。它通过抑制细胞周期蛋白依赖

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