CRISPR / Cas9介导快速增长的蓝藻伸长球菌UTEX 2973的定向突变外文翻译资料

 2022-08-08 09:08

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CRISPR / Cas9介导快速增长的蓝藻伸长球菌UTEX 2973的定向突变

克里斯汀·温特 1，贾斯汀·昂格 1，瑞安·科布 2，赵慧敏 2和希玛德里·B·帕克1*

摘要

背景:：作为自养原核生物，蓝藻是可持续生产各种有用化合物的理想底栖生物。最新发现的蓝藻拉长链球菌UTEX 2973由于其异常快速的生长速度，有望成为微生物细胞工厂的候选者。在这里，我们试图开发一个基因工具包，通过CRISPR/Cas9编辑系统，实现对Synechococcus 2973的广泛基因组工程。我们将nblA基因作为靶点，因为它在硝基剥夺条件下的生物学反应中起着重要作用。

结果：首先，我们确定化脓性链球菌Cas9酶在蓝藻中有毒，并且含有Cas9基因的稳定复制结构物的接共轭转移导致了致命性。然而，在转换到允许cas9基因瞬时表达的载体后，我们在第一个贴片后100%的蓝藻外结合体中实现了无标记编辑。而且，我们可以很容易地解决细菌的耐药性，导致无标记的删除应变。

结论：联合球菌2973中Cas9蛋白的高表达具有毒性，可导致细胞凋亡。然而，在质粒骨架上引入CRISPR/Cas9基因组编辑系统进行cas9的短暂表达，使得对野生型遗传背景下的蓝藻进行有效的无标记基因组编辑成为可能。

关键词：蓝藻、联合球菌、CRISPR、Cas9、基因组修饰

背景

光合微生物在固碳，燃料生产，药物合成方面的应用引起了人们极大的兴趣。利用蓝藻作为生物工厂的优势在于它们仅靠二氧化碳和阳光就可以生长，降低了温室气体的排放和对石油产品的依赖。此外，蓝藻是质粒体进化的原型生物，而且也是研究光合作用机制的模型。通常研究的蓝藻，如Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechococcus sp. PCC 7002和Synechocystis sp. PCC 6803已经通过基因工程产生了多种有用的产品，包括乙烯[3]、氢[4]、游离脂肪酸[5]、乙醇[6]，以及异戊二烯[7]。另外，通过基因操作删除相互竞争的途径，可以重新连接中枢代谢和将碳吸收重新定向到最终产品中[8，9]。一种新鉴定的蓝藻菌株—联合球菌2973，有潜力成为代谢工程和生物学研究的多用途底盘。在1.9小时的倍增时间内，联合球菌2973具有与酿酒酵母相似的生长速度[10]。联合球菌2973的基因组序列与模式生物联合球菌7942的基因组序列一致性为99.8%。模式生物联合球菌7942的倍增时间较慢，为4.9小时。然而，由于缺乏有效的遗传修饰系统，发展联合球菌2973作为模型受到限制。联合球菌7942有能力提取裸DNA，而联合球菌2973不行。尽管联合球菌2973已被证明能够进行DNA的共轭转移，但是在共轭转移后的基因组的改造发生几率比联合球菌7942和其他模式蓝藻要低。目前的联合球菌基因操作系统已经很成熟了，但是，通常需要很长的时间才能产生所需的基因突变株。通常用于在联合球菌中构建缺失型突变株的策略依赖于自杀载体和宿主染色体之间的同源重组，涉及用选择性标记替换感目标基因[11]。附加遗传通过整合其他抗生素抗性标记进行改变。这限制了路径工程，因为可用的抗生素盒数量有限。此外，蓝藻保持着染色体的多个拷贝，多轮分离通常是获得完全分离的突变体所必需的[12]。尽管联合球菌2973的基因组拷贝数尚待确定，但联合球菌7942细胞包含三到四个基因组拷贝。因此，分离过程可以在选择性培养基上进行一周的分离，以获得分离的菌株。

无标记删除策略的发展依赖于显性链霉素敏感rps12突变[13]。这个系统的一个主要缺点是它需要在遗传背景下工作，这个背景需要适当的rps12突变。另外，这个策略很耗时，因为它依赖于两个后续转型。最近，CRISPR/Cas9系统已经成为多功能的编辑平台，应用于各种有机体的无标记的突变 [14–16]。然而，CRISPR/Cas9系统在蓝藻的基因编辑中的使用还没有普及。

在自然界，CRISPR/Cas9系统提供给细菌适应性免疫力，它通过切割和降解外源DNA来抵抗病毒和质粒的入侵[17]。一旦感染，入侵者序列被合并为CRISPR数组中一系列回文重复序列之间的间隔序列[18，19]。CRISPR阵列被转录加工成两个RNA成分：crRNA和tracrRNA[20]。它们被用来引导Cas9核酸酶进入复合靶序列，在这里Cas9使双链断裂[18]。CRISPR系统可以通过重新编程与遗传目标互补的间隔序列进行基因组的编辑[21]。定向断裂通过双同源重组被修复，在此期间同源序列作为修复模板[22，23]。通过提供包含目标序列的预期变化，特定基因组的修复模板，突变或缺失可能发生在切割部位。

尽管还没有任何应用CRISPR/Cas9蓝藻基因组编辑系统的例子，但是已经进行了一些研究，旨在确定原生蓝藻CRISPR系统[24，25]。目前对长链链球菌CRISPR/Cas系统的研究还很少。然而，各种蓝藻基因组的计算分析已经预测到存在各种IA、IB、IIA、IIB、IIC、IID、IIE、IIF、IIG和III CRISPR/Cas亚型组合[24、26]。此外，最近的研究旨在开发一个CRISPRi系统，用于蓝藻的基因抑制[27]。

在目前的研究中，我们重新调整了CRISPR/Cas9的用途，该系统最初是为利维达斯链霉菌的基因组编辑而开发的，现在用于快速生长的蓝藻联合球菌2973[28]。我们利用质粒的衍生物，将一个无标记的缺失导入联合球菌2973，并确定突变菌株在第一个补丁中完全分离。除了作为代谢基础研究模型，蓝藻也是可以更好地理解光合过程的理想系统[29]。因此，为了证明CRISPR/Cas9系统可以产生无标记缺失突变体，我们选择了nblA基因作为靶点，该基因在细胞对营养缺乏条件的反应中具有重要作用。蓝藻有大的触角蛋白复合体，可以收集光进行光合作用[30]。这些原核生物的一个有趣的特征是它们能够根据营养物质的有效性调节这些天线复合体的大小和结构[31]。NblA参与了藻胆体的降解，藻胆体是与光系统II相关联的主要天线蛋白复合物之一[32]。通过靶向使nblA缺失，我们证明CRISPR/Cas9系统可以更好地表征生物重要基因的功能。

这一改进的基因组编辑方法有望对联合球菌株进行快速高效的基因编辑。此外，使用CRISPR/Cas9进行编辑的次数，不受抗生素盒选择的限制，并可对宿主基因组进行广泛修改，以生产有用的生物制品。

结果

开发基于RSF1010的CRISPR/Cas9系统

我们最初尝试使用介质拷贝数质粒主干pVZ321（一种基于RSF1010的主干）组装一个完整的CRISPR系统，该主干在蓝藻中保持稳定[33，34]。我们选择nblA基因作为缺失的靶点[32]，nblA基因是联合球菌2973中藻胆体降解的必要成分。这些突变体有一种视觉上可以检测到的表型。野生型联合球菌2973菌株在缺乏硝酸盐的培养基中生长时，表现出黄色漂白，这是羟基磷灰石降解的特征。在这些条件下，nblA缺陷型菌株具有明显的非漂白表型，并且保持绿色。此外，只有当nblA的所有副本都被删除时，漂白才是明显的，这使得它可以作为隔离的视觉标记。

构建的pVZ321含有化脓链球菌cas9（来源于pCRISPomyces-2），一种设计用于靶向nblA的合成引导RNA（sgRNA），以及介绍nblA删除的编辑模板。在多次尝试与此结构结合后，我们无法恢复外连接体。然而，缺少CRISPR/Cas9系统的同一主干在两次结合尝试中各自产生了约250个菌落。为了检测cas9的毒性，我们设计了pVZ321骨架，使其只含有cas9。我们再次无法从与含cas9质粒的结合中恢复菌落。为了规避cas9的毒性，我们通过去除上游序列的500对碱基，包括核糖体结合位点和启动子，将表达降低到基础水平。将得到的质粒接合到Synechococcus2973中，在两次尝试中每次都产生不到5个外连接子，而不含cas9的载体产生约250个外连接子。

pCRISPomyces-2crispr/Cas9系统的应用

在pVZ321主干上几乎没有成功的经验，我们转向了一个向量器，理论上允许cas9的瞬时表达：来自赵实验室的pCRISPomyces-2结构。该载体的复制依赖于链霉菌的复制，该复制在34°C以上不起作用[35]。在我们的研究中，所有的接合实验都在38°C（合球菌2973的最佳温度）下进行，这高于加纳链球菌的允许复制温度。这使得cas9在接合到Synechococcus 2973后可以直接瞬时表达，但阻止了毒性基因的长时间表达，因为质粒在转化为蓝藻后可能不会复制。我们通过插入靶向nblA的sgRNA和设计用于引入nblA缺失的编辑模板（图1a），将pCRISPomyces-2载体修饰为靶向Synechococcus 2973中的nblA。我们采用了一种不依赖将选择性标记整合到基因组中的删除策略，作为进行无标记基因组修改的概念证明。采用三亲交配法将△nblA-CRISPR结构引入合成球菌2973。抗生素选择性用于强制质粒在基础水平上暂时持续存在。一个典型的结合产生21个菌落，其中一个子集落在缺乏硝酸盐的培养基中进行漂白试验（图2）。另外，PCR和Sanger测序用于确认非漂白表型是nblA缺失的结果，而不是在氮剥夺条件下未能漂白的菌落中的单一重组事件。

图1使用pCRISPomyces-2主干构建质粒，以设计△nblA线。a包括cas9的nblA缺失质粒；b描述了不包括cas9的nblA编辑质粒

图2在缺氮条件下，2973分离的联合球菌不表现出特征性的漂白。用三亲交配法将△nblA-CRISPR/Cas9质粒导入联合球菌2973。结合后体被接种在选择性的培养基并且在标准和脱氮条件下转移到液体培养基中。

CRISPR/Cas9介导编辑的评价

为了确定依赖于Cas9切割的编辑比例，我们构建了一个二级结构，其中Cas9基因被删除（图1b）。用三亲交配法将-cas9结构引入2973多聚球藻，比较不同的分离株产量。我们用聚合酶链反应（PCR）来评估是否对结合后体进行了编辑和分离（表1；图3）。

即使在假定不允许复制的条件下，抗抗生素的突变体的存在表明编辑质粒被保存。我们通过进行PCR检测来证实这一点，以检测外连接体中是否存在cas9（图4）。

CRISPR质粒系统治疗编辑的潜力评估

为了确定是否能治愈cas9和阿普霉素耐药标记物，将菌落接种在缺乏抗生素选择的培养基上。到了第十个补丁，在含有抗生素的平板上看不到生长（图5）。此外，有机体在选择性培养基上失去生长能力后，我们用PCR检测是否存在cas9，发现我们无法在第十个片段中扩增出该基因（图4）。

讨论

在联合球菌2973中，Cas9有毒

不能产生大量含有cas9的结构物的结合后体表明，当该基因被引入到一个中等拷贝数的质粒上时，它在联合球菌2973中是有毒的。与去除cas9-RBS的结构物结合后仅产生5个菌落（与缺乏cas9结构物的约250个菌落相比）这一事实表明，就cas9毒性而言，这些例外菌落是“逃逸者”。此外，我们认为在中拷贝数水平上，该基因在联合球菌中不能稳定维持。尽管目前还不清楚Cas9毒性的原因，但有一种可能是化脓性链球菌Cas9在蓝藻细胞中具有非靶向效应。这种酶可能在非合成sgRNA靶向的区域切割基因组DNA，细胞无法修复这些断裂，从而导致死亡。

瞬时cas9表达实现基因组编辑

在转换到促进cas9（pCRISPomyces-2）瞬时表达的质粒骨架后，我们发现我们能够设计出预期的nblA缺失菌株。在缺氮条件下，所有的结合后体都没有漂白，表明nblA已被编辑。由于该生物体不能保留nblA的任何功能拷贝以显示非漂白表型，这也表明分离已经发生，只有突变的基因组拷贝仍然存在。我们能够产生抗药性的分离物这一事实表明，联合球菌2973系统和链霉菌lividans系统的允许复制温度不同。我们认为，在38°C的温度下，多聚糖酶-2的主链在基础水平上在2973多聚球菌中复制。PCR分析表明，cas9存在于早期斑块中，但不存在于后期斑块中（图4），这表明它在性质上是短暂的。

表1 结合结果表明，质粒骨架对编辑的成功有一定的影响

图3利用双同源重组产生无标记缺失。a：导致染色体上nblA缺失的双同源重组事

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