用于电化学测定活细胞释放的超氧阴离子的多级多孔碳网络的制备外文翻译资料

 2022-08-27 10:08

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用于电化学测定活细胞释放的超氧阴离子的多级多孔碳网络的制备

摘要：

实现超氧阴离子(O2·-)的定量检测，对于基于O2·-与许多疾病的相关性的病理研究具有重要意义。目前，实际样品中O2·-电化学检测的主要挑战是开发有效的纳米模拟材料来取代天然酶，实现对O2·-的高选择性检测。本研究通过1,3,5-三甲基苯(TMB)诱导自组装和炭化反应成功制备了多级多孔碳网络(HPCN)。由于TMB的引入，HPCN的形貌发生了变化，孔隙结构丰富，缺陷程度提高，促进了传质，电子转移效率提高。因此，用HPCN制备的非酶O2·-电化学传感器(简称HPCN/SPCE)具有较高的灵敏度(607.4 mu;A cm-2 mM-1)和对O2·-的选择性。重要的是，该传感器成功地实现了活细胞释放氧气的动态监测，并具有区分癌细胞和正常细胞的潜力。

1.引言：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是生物有氧代谢的重要产物，主要包括羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2·-)、单线态氧(1O2)和过氧化氢(H2O2)。其中，O2·-的自由基是初级ROS的一种，可以转化为其他类型的ROS。在正常的生理条件下，O2·-的产生和去除处于动态平衡，同时，O2·-扮演着第二信使的角色，在机体的代谢和生理功能中起着至关重要的作用，如转录激活、细胞促增殖、细胞凋亡等。然而，当动态平衡被破坏时，通过诱导DNA序列的改变，过量的氧化应激可引起多种疾病，如阿尔茨海默病和癌症。因此，对生物体内氧的实时监测对病理研究具有重要意义。

人们提出了多种检测O2·-的方法，包括电子顺磁共振(EPR)、荧光探针、高效液相色谱(HPLC)和电化学(生物)传感器。其中，电化学传感器具有操作简单、灵敏度高、实时监测等优点，引起了人们的极大关注。迄今为止，基于超氧化物歧化酶(SOD)的O2·-电化学传感器是一种被广泛报道的酶基生物传感器。虽然这种基于酶的传感器具有较高的选择性，但其性能容易受到外界条件的影响。因此，人们开发了基于各种纳米材料的非酶电化学传感器，以提高传感器的稳定性。遗憾的是，大多数纳米材料对O2·-检测的选择性往往不如酶，因此在实际样品分析中很难分辨过氧化氢(H202)等生物小分子的干扰。因此，在考虑催化活性的同时，设计和制备高选择性的纳米材料进而实现对O2·-的特异性检测是当务之急。

碳纳米材料由于具有SOD模拟活性并且可用于对O2·-的检测而被广泛报道。特别是多孔碳材料，其催化活性高，电导率好，是理想的酶替代品。虽然具有高比表面积的微孔碳材料可以提供大量的活性位点，但活性位点通常局限在微孔中，导致传质过程困难。而介孔/大孔材料可以提供更多有效的活性位点来促进电子转移，加速电化学反应。因此，有可能制备具有更容易获得的活性位点的多级多孔材料，以促进传质和提高电催化活性。目前，通过引入多种前驱体或成孔剂来设计材料的孔隙结构已成为研究的重点。此外，有报道称1,3,5-三甲基苯(TMB)可以作为膨胀剂改变材料的多孔结构，进而影响催化性能。

在本工作中，通过TMB诱导的自组装和炭化策略，制备了层次化多孔碳网络结构(简称HPCN)。合成的碳网络具有高比表面积、丰富的孔结构、缺陷程度提高等特点。由于这些特性，用HPCN制备的O2·-传感器具有较高的灵敏度和优越的选择性，从而通过监测细胞在药物刺激下释放的O2·-来大致区分肿瘤细胞和正常细胞。

2.实验

2.1.试剂与材料

氨水、间苯二酚、甲醛、无水二甲基亚砜(DMSO)、18-冠醚-6以及1,3,5-三甲基苯(TMB)购自阿拉丁工业公司。Pluronic F127是上海耐诚生物有限公司的产品。D-葡萄糖 (Glu)、尿酸(UA)、H2O2、抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)和酵母多糖A由Sigma-Aldrich提供。K3[Fe(CN)6，K4[Fe(CN)6]，NaCl,K2SO4，KH2PO4，K2HPO4从国药化学试剂有限公司购买。实验用水均为实验室水净化系统的超纯水。电化学实验用的PBS在实验前通过氩气处理10 min以上，除去溶解氧。

2.2.表征

采用透射电子显微镜(TEM, JEOL, JEM-1400)和扫描电子显微镜(SEM, JEOL, JSM-660LV)对其形貌和表面结构进行表征。拉曼光谱由激光显微拉曼光谱仪(InVia反射)使用532nm激光获得。x射线衍射分析采用D/MAX-2550衍射仪(日本Rigaku国际公司)进行。采用Micromeritics ASAP 2020 V 4.02系统进行氮吸附-解吸实验。用ELISA仪(Thermo Scientific Multiskan MK)测定细胞活力。电化学实验均在CHI 660D电化学工作站进行。

2.3.HPCN与CS的合成

HPCN是根据文献报道经过修饰合成的。先将0.2 mL氨水加入到含有16 mL乙醇和40 mL超纯水的溶液中，在30 ℃下搅拌0.5 h，然后在搅拌下加入0.2 g Pluronic F127，直到混合物变透明。随后，将0.5 mL TMB缓慢注入上述溶液中，连续搅拌30 min，再加入间苯二酚0.4 g和0.56 mL甲醛水溶液，在30 ℃下继续搅拌24 h，形成白色乳液。然后，将乳剂转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在100 ℃下保持24 h。聚合物中间体冷却至室温后，离心收集，用超纯水和乙醇洗涤3次，真空烘干过夜。对于碳化,把得到的聚合物中间体在氮气的保护下在350 °C下预热2 h，升温速率为2 °C/min,然后进一步以1 °C/min的升温速率加热到800 °C并维持2 h。自然冷却后得到了HPCN的黑色固体粉末。为了比较，在相同的工艺下，不添加TMB合成了碳球(记为CS)。

2.4.修饰电极的制备

将2 mg HPCN超声分散于1 mL的水-乙醇体积比为3:1的混合溶液中，然后将上述溶液滴于自制的丝网印刷碳电极(SPCE)表面。干燥后，在上述电极表面滴加2 mu;L 0.05 wt% 全氟磺酸，得到HPCN修饰电极(HPCN/SPCE)。同样，制备了CS纳米材料修饰的SPCE(CS/SPCE)。

2.5.O2·-的产生系统

根据文献资料制备了超氧阴离子原液。用超声波将0.0355 g KO2粉末分散于含0.264 g 18-冠醚-6的DMSO中。根据O2·-在DMSO中的摩尔吸收率(2006 M-1 cm-1，在271 nm下)，用紫外-可见光谱法测定O2·-的浓度。

2.6.MTT法和炎症刺激

HepG2细胞(人类肝癌细胞)和H9c2心肌细胞，在37oC下以及一种由95%的空气和5%的二氧化碳组成的加湿的气氛中，在培养瓶中无菌培养，培养瓶中有5 mL的含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。采用MTT法评价材料的生物相容性。详细来说，首先把细胞以大约每个孔2times;104 mL-1的密度播种到96孔的板中维持24 h，,然后添加含有不同浓度样品(2 mg/mL，0.2 mg/mL，0.02 mg/mL，0.002 mg/mL和0 mg/mL)的DMEM培养基并且继续将细胞培养24h。接着，每孔加入MTT，再培养4 h。最后去除MTT，每孔加入150mu;L DMSO并用ELISA仪测定荧光值。

为了测定细胞释放的O2·-，首先收集细胞，1000 rpm离心5 min，分散于5 mL PBS中。显微镜下计算细胞密度为8times;105 mL-1。然后用HPCN/SPCE记录两种细胞在酵母多糖A刺激下释放的O2·-电流信号，同时用细胞培养液评价构建传感器的真实样本恢复情况。

3.结果与讨论：

3.1.制备及表征

如图1所示，分层孔碳网络(HPCN)的形成可分为以下几个步骤。首先在水/乙醇体系中形成F127胶束，然后加入TMB作为膨胀剂形成F127/TMB胶束。下一步，将碳前驱体间苯二酚和甲醛(RF)加入到F127/TMB胶束表面，形成低交联的RF团簇，并在水热过程中形成高交联的RF聚合物。最后，聚合物在惰性气氛下碳化，得到最终产物HPCN。采用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)对合成材料的形貌和结构进行了测定。如图1A和B所示，在没有TMB的情况下，聚合物呈现出非球形形貌，而在合成过程中加入TMB，聚合物呈现出交织的多孔骨架管状网络结构。原因可能是TMB的加入降低了Pluronic F127的亲水/疏水体积比，通过胶束的组装导致了不同的结构。同时，同时，TMB的膨胀作用使胶束粒径增大，使孔结构清晰可见。CS和HPCN在碳化后都表现出一定程度的收缩聚集，如图1C和D所示。这可以归因于间苯二酚-甲醛聚合物在热解过程中的向内收缩。从SEM图像(图1E和F)可以看出，CS颗粒形成了致密的结构，而HPCN呈现出疏松的多孔结构，这有利于电解液与电极表面的接触。

采用氮气吸附-解吸等温线进一步考察了样品的孔隙结构。从吸附-解吸等温线(图2A)可以看出，CS和HPCN均具有微孔结构，在低相对压力区域出现了急剧上升。同时，在高相对压力区域，HPCN的吸附体积明显大于CS，说明HPCN含有更多的中/大孔。通过BET方法计算，HPCN和CS的比表面积分别为686.69 m2g-1和748.50 m2g-1。其中，CS具有较高的比表面积可以归因于其较高的微孔比。根据基于密度泛函理论(DFT)分析的孔径分布图(图2B)，HPCN广泛分布于中/大孔范围，相对于以微孔为主的CS具有丰富的孔隙结构，这与HPCN独特的网络结构密切相关。对于电催化而言，这些分级多孔材料可以提供更多易接近的活性位点，提高电子转移效率，加速电化学反应，从而呈现出令人满意的催化性能。

利用拉曼光谱对制备材料的石墨化程度和缺陷进行了研究。如图2C所示，1350 cm-1处的峰为D波段，这是由碳的不规则结构或低对称结构造成的，而1596 cm-1处的峰为石墨晶体结构中共轭C=C振动相关的G波段。通常用两个峰的强度比ID/IG来了解碳材料的缺陷程度。强度比越大，缺陷的程度越高。计算HPCN和CS的ID/IG分别为1.91和1.85。这一结果表明，合成过程中TMB的加入有效地提高了缺陷程度，可以为催化反应提供更多的缺陷位点。HPCN和CS的x射线衍射(XRD)图谱(图S1)显示在2Theta;=25o和44o附近有两个宽的衍射峰，对应于石墨的(002)和(100)平面。这是无序碳质结构的特征，与拉曼结果一致。根据以上结果，我们可以知道800 ℃碳化后的聚合物网络没有完全石墨化，证实了大量的结构缺陷的存在。有研究表明，边缘和缺陷位置有利于提高催化性能，因为缺陷区域的悬空基团可以改变局部Pi;电子密度，提高化学活性。因此，合成材料的催化活性取决于其具有众多缺陷和层次孔隙的固有结构特征，这可以提供众多的催化中心去与更多的底物分子相互作用，提高催化效率。

3.2.修饰电极的电化学行为

在含5 mM Fe(CN)63-/4-的100 mm KCl溶液中，采用循环伏安法(CV)表征了不同修饰电极的电化学行为。如图S2所示，由于电导率低和有限的电活性表面积，单独的SPCE的氧化还原峰并不明显。经CS修饰后，CS/SPCE的氧化还原峰会出现156 mV的峰-峰电位分离(Delta;Ep)。而对于HPCN/SPCE，峰值电流密度明显增强，Delta;Ep降低至14 mV，验证了HPCN的多级多孔网络结构保证了电解液与电极表面的有效接触，并通过提供更容易接近的活性位点来促进电化学反应。

采用电化学阻抗谱(EIS)实验对修饰电极的界面性能进行了评价。如

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