PCN-250固定化纤维素酶在离子液体中的稳定性研究外文翻译资料

 2022-03-13 11:03

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摘要：离子液体（IL）作为有效处理木质纤维素生物质的预处理溶剂已引起广泛关注。然而，已知IL使纤维素酶严重失活。在这项研究中，Paenibacillus sp。的相对活性。相对于羧甲基纤维素（CMC），滤纸（FP）和微晶纤维素（MCC），在1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸酯（[Emim] DEP）存在下分析了LLZ1纤维素酶（PCs）。随着[Emim] DEP浓度的增加，PC会根据底物而受到不同程度的抑制。随后，分析动力学参数Kmand Vmax。 Kmindic的显着增加表明[Emim] DEP对酶对底物MCC的亲和力产生了负面影响。比较而言，Vmax的影响很小。对不同底物含量的相对MCCase活性的进一步研究表明，在较高底物浓度下，PC的抑制作用较小。最后，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，低[Emim] DEP浓度（小于30％）时，内切葡聚糖酶的失活是可逆的，而高[Emim] DEP浓度（大于40％）时，不可逆性开始。在不同的内切葡聚糖酶中观察到了[Emim] DEP的不同作用。

关键词：离子液体，纤维素酶，芽孢杆菌LLZ1，失活，内切葡聚糖酶

■引言:木质纤维素生物质是地球上最丰富的生物质，作为生物精炼工艺的可再生原料具有巨大潜力[1]。木质纤维素原料衍生的生物燃料和化学品是常规石油基产品的主要替代品[2,3]然而，木质纤维素生物质的有效利用面临的最大挑战 Swatloski等[4]为提高木质纤维素的消化率，开发了多种物理或化学预处理方法。 报道了纤维素在1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物（[Bmim] [Cl]）和其他ILs中的溶解[5]。从那时起，ILs就被广泛地研究了在生物质预处理中的潜力。 由于增加了生物质的酶促速率IL预处理后，基材的孔隙率降低，结晶度降低。[6,7]先前的研究包括在再生和酶水解之间洗涤再生木质纤维素生物质的步骤。[8,9]为了简化整个过程，Kamiya等人。 提出了原位糖化的概念，其中在不去除IL的情况下整合了再生和酶促水解.[10]最近，原位糖化已实现了木质纤维素生物质的高转化率（大于90％）。[11-13]然而，最纤维素分解的活性 酶遭受IL的存在。 纤维素酶明显减少即使存在痕量的IL，也可以报道其活性。[14]此外，一些研究表明IL浓度对纤维素酶的影响。[14-21]发现，纤维素酶的活性被30％1,3-二甲基-3-甲基咪唑鎓完全抑制了。磷酸二甲酯（[Dmim] -DMP）。然而，稀释IL后，该酶的催化活性得以恢复，这表明该失活是可逆的。另一项研究表明，纤维素酶在纯的1-乙基-3-甲基咪唑乙酸酯（[OA]）中在4小时内丧失了全部活性。用缓冲液稀释后，酶没有恢复任何活性，这表明由纯[Emim] OAc引起的失活是不可逆的。[22]此外，据报道，纤维素酶的活性受底物影响。恩格尔（Engel）等人。发现可溶底物的相对酶活性比不溶性alpha;-纤维素高得多。Zhao等 [23]，IL溶液中的纤维素酶活性也与温度相关。[24]迄今为止，关于IL对纤维素酶的抑制机理的数据还很有限。因此，需要进一步的研究来研究IL介导的纤维素酶失活过程。在我们先前的研究中，将1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸酯（[Emim] DEP）与二甲基亚砜组合使用作为预处理溶剂用于糖化。 IL [Emim] DEP被证明是优于1-烯丙基-3-甲基咪唑鎓氯化物（[Amim] Cl），1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物（[Bmim] Cl），乙酸1-丁基-3-甲基咪唑鎓的优良溶剂（[Bmim] OAc）和乙酸1-乙基-3-甲基咪唑鎓盐（[Emim] OAc）。但是，与[Emim] OAc，[Bmim] Cl和[Dmim] DMP失活相比，对] DEP的研究较少。因此，[Emim] DEP诱导的纤维素酶失活的分析是必要的。在本研究中，Paenibacillussp。的失活机理。研究了在[Emim] DEP存在下的LLZ1纤维素酶（PC）。针对几种不同的底物分析了PC的相对活性。然后确定动力学参数以进一步分析离子液体对酶活性的影响。特别是，在[Emim] DEP预处理后，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来观察不同PC的变化。

■材料和方法:[Emin] DEP（纯度99％，水含量0.13％）购自晨捷化工有限公司（中国上海），无需进一步纯化即可使用。聚合度为210-240和Whatman No.1的微晶纤维素（MCC）滤纸（FP）购自国家药典化学试剂有限公司（中国上海）。蔗渣得自江苏（中国），用蒸馏水洗涤，在85°C下干燥至恒重，然后研磨并通过40目筛子。细菌菌株和纤维素酶。芽孢杆菌本研究中使用的LLZ1以前是由我们小组从土壤样品中分离出来的。该菌株在含有磷酸氢二钠3 g / L，硝酸铵0.8 g / L，硫酸七水合0.5 g / L，氯化钙0.5 g / L，蔗渣的液体培养基中培养。粉末5.0 g / L，酵母提取物2.0 g / L。在30°C和200rpm下生长3天后，将培养物以6000g离心5分钟，并用0.22mu;m尼龙滤膜过滤。将无细胞的上清液用作粗纤维素酶。粗纤维素酶的活性根据国际标准程序确定。纯粹与应用化学联合会[25]，但有一些修改。通过将粗酶与羧甲基纤维素（CMC）底物在40°C下温育30分钟来进行CMCase活性。非典型反应混合物包含0.5mL的粗酶和0.5mL的溶于0.1M乙酸缓冲液（pH 6.0）中的2％CMC。 FPase活性是通过将40 mL在1 mL乙酸缓冲液（0.1 M，pH 6.0）中的0.5 mL粗酶与50 mg Whatman No.1滤纸作为底物孵育1 h来进行的。除了代替MCC作为底物外，在与FPase活性相同的条件下进行MCCase活性。温育后，通过3，5-二硝基水杨酸（DNS）方法定量释放的还原糖的量。为了确定阴离子液体对酶参数的影响，将IL加入反应混合物中。用HCl将pH值重新调节至6.0，以消除由IL引起的pH变化。纤维素酶的运动学参数。动力学参数是使用范围从10到70 g / L的不同浓度的底物测定的。反应混合物由0.5mL粗酶和1mL底物溶液（0.1M，pH 6.0）组成。温育15分钟后，通过DNS方法量化释放的还原糖的量。根据Lineweaver-Burk方程计算纤维素水解的米氏常数（Km）和最大速度（Vmax）。电泳和纤维素酶活性的Zyogram分析。将200mu;L粗纤维素酶在真空中冷冻干燥，然后在15mu;L不同浓度的IL（pH 6.0）中于40°C孵育1 h。随后，将所有混合物用相同量的乙酸缓冲液（0.1 M，pH 6.0）稀释。稀释的结果是，IL含量降低到小于5％。 SDS-PAGE样品通过混合8mu;L稀释混合物和2mu;L不加还原剂的凝胶上样缓冲液来制备。如先前所述，将样品在8％含0.1％Na-CMC作为底物的分离凝胶上进行分离[26,27]。电泳后，将凝胶在室温下于不饱和缓冲液（0.1 M乙酸缓冲液，pH 6.0，含有2％Triton X-100）中孵育1 h，然后在无Triton X-100的相同缓冲液中于4°浸泡12 h C。随后，将凝胶在40°C下孵育1小时，在0.1％刚果红中染色30分钟，然后使用1 M NaCl脱色。纤维素分解带在红色背景上显示为透明区域。

■结果与讨论:[Emim] DEP对纤维素酶活性的抑制。某些水解酶（例如胰凝乳蛋白酶和某些脂肪酶）在纯IL中保持活性，或表现出增强的热稳定性，选择性和对映选择性与传统溶剂相比。很少有研究报道纤维素酶可以耐受高浓度的IL。[28]Turner等人。首先报道了里氏木霉（Trichoderma reesei）由IL诱导的纤维素酶失活，其中仅用22 mM的[Bmim] Cl观察到活性减弱。[29]迄今为止，仅广泛报道了商业纤维素酶在IL溶液中的活性。[30]通常，[Bmim] Cl， [Emim] OAc，[Amim] Cl和[Dmim] DMP在纤维素糖化中用作预处理溶剂。据报道，即使在这些ILs的低浓度（10％）下，里氏木霉纤维素酶的活性也降至15-30％。我们最近的研究表明，在[Emim] DEP存在下，葡萄糖的产量为1.42-，1.29-，1.19-。分别比[Bmim] Cl，[Emim] OAc，[Amim] Cl和[Bmim] OAc高1.52倍。但是，[Emim] DEP引起的失活的研究较少。这里，PC的失活被研究了。图1显示了在不同[Emim] DEP浓度下PC的相对活性。针对三种底物测定了[Emim] DEP的效果。像大多数纤维素酶一样，PC的活性随[Emim] DEP的浓度而降低增加。 但是，CMCase，FPase和MCCase活性显示出各种明显下降的趋势。 在[Emim] DEP的0-20％范围内，CMCase的相对活性高于88％，而FPase的相对活性则显着下降。 在[Emim] DEP浓度为10％和20％时，FPase的相对活性分别降至41％和14％。 此外，MCCase活性显示出适度的下降趋势。 由于将[DEM] DEP浓度从0增加到20％，MCCase的活性从100％减少到64％。 这些结果清楚地表明，纤维素酶的抑制是底物依赖性的。 一种可能性是CMC，FP和MCC的水解可能需要不同的内切葡聚糖混合物-图1。增加[Emim] DEP浓度和不同底物对PC相对活性的影响。 误差线表示三个独立实验的标准偏差内切酶，外切葡聚糖酶和beta;-葡萄糖苷酶，以及白介素对纤维素酶的不同组成有不同的影响。在最近的一项研究中，恩格尔等人。 研究了[Dmim] DMP对单个纤维素酶的影响。 结果表明，在10％的[Dmim] DMP中，对氨基葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和beta;-葡萄糖苷酶的相对活性分别保持为63％，60％和34％。[31]下面提出了其他可能的解释。[Emim] DEP对 芽孢杆菌 LLZ1纤维素酶的动力学参数。 为了进一步研究离子液体对酶活性的影响，确定了动力学参数。 尽管通常使用CMC和FP，但它们不能反映实际的工业应用，因为从木质纤维素生物质中提取的纤维素原料是粉末状且不溶的。 因此，选择MCC来研究IL浓度升高对纤维素酶动力学参数的影响（表1）。观察到随着[Emim] DEP量的增加，Kmin急剧增加，表明酶对MCC的亲和力降低。 有趣的是，尽管[Emim] DEP明显抑制了MCCase活性，但Vmax仅略有降低。 例如，在[Emim] DEP浓度为10％和20％时，MCCase活性分别下降了20％和36％，而Vmaxonly下降了10％和21％。 为了解释这种现象，我们测量了不同底物含量的相对MCCase活性。 Vmax和MCCase活性之间的差异代表了在不同底物浓度下的催化效率。 对于Vmax，底物已饱和，这比MCCase活性估计中使用的底物显着更多。 图2清楚地表明，MCC的增加导致相对MCCase活性的增加，表明图2.底物含量对PC相对活性的影响。对照实验是在没有[Emim] DEP的缓冲液中进行的。 误差线表示来自三个独立实验的标准偏差

这表明在较高的底物浓度下酶的活性受到的抑制较小。这与上述观察结果一致，即Vmax受[Emim] DEP的影响较小。在先前的研究中，纤维素酶在存在再生纤维素的情况下表现出增强的热稳定性。由于此类纤维素具有更易接近的表面，因此纤维素酶在底物上的吸附增强可以保护它们。同样，较高的底物含量也可以为纤维素酶提供更易接近的表面和结合位点，从而保护它们免于失活。在[Emim] DEP对纤维素酶活性的抑制一节中，观察到了对纤维素酶的底物依赖性抑制作用。应该注意的是，CMC是水溶性的，因此表现出丰富的结合位点。但是，MCC和FP不溶。但是，由于粉末的一致性，MCC比FP具有更易接近的表面和结合位点。在这种情况下，底物的可及表面和结合位点可能是抑制强度顺序的另一个特征：CMCase lt;MCCase lt;FPase。[Emim] DEP处理的Paenibacil-lus sp的SDS-PAGE分析。 LLZ1纤维素酶。微生物分泌的纤维素酶具有自然多样性。 Pason等。报导了库氏杆状芽孢杆菌B-6产生的多种酶，包括12种木聚糖酶和9种CMCases.[32]廖等人。表明纤维素酶可以被木聚糖和纤维素强烈诱导，从而导致大量的纤维素酶。[33]在过去的几年中，人们已经尝试从极端的环境中分离出耐IL的纤维素酶。因​​此，将多种纤维素酶直接用于原位糖化。因此，有必要研究IL对各种纤维素酶作用的潜在机理。采用SDS-PAGE酶谱分析法研究[Emim] DEP对PC的作用。在不同浓度的[Emim] DEP中孵育1小时后，将纤维素酶稀释并进行电泳。如图3所示从凝胶中检测到至少六个内切葡聚糖酶（CMC1-CMC6）。 直到[Emim] DEP的30％之前，水解带都没有观察到变化，这表明低[Emim] DEP浓度下的失活是可逆的。然而，在40％时，一些水解带开始消失。CMC1和CMC2的重新活化可以 不能用缓冲液稀释IL-纤维素酶溶液来实现，这表明不可逆失活的开始。 由于氢键和疏水相互作用的破坏，已经提出了ILs抑制酶的活性。[Emim] DEP的干扰可能随着图3的增加而增加。[Emim] DEP浓度的增加对Paenibacillus sp.endoglucase的影响。LLZ1因此，[Eimim] DEP浓度在30％-40％范围内导致某些内切葡聚糖酶的不可逆结构变化。显然，当[Emim] DEP的浓度增加到50％时，稀释后纤维素酶几乎没有恢复活性。在[Emim] DEP浓度为50％时，CMC1和CMC2之间只出现了一条轻微的水解带。一个可能的原因可能是内切葡聚糖酶在[Emim] DEP溶液中孵育过程和随后的稀释过程中形成聚集体，从而导致酶解折叠和重新折叠。聚集体因此导致分子量更高和酶活性降低，形成了滞后并略微水解。值得注意的是，在40

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