microRNA-451调控巨噬细胞游走抑制因子的产生 和胃肠道癌细胞的增殖外文翻译资料

 2022-01-02 09:01

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microRNA-451调控巨噬细胞游走抑制因子的产生

和胃肠道癌细胞的增殖

翻译：倪懿矾，专业班级：生物技术1501，指导老师：张德禄

摘要

【目的】 microRNAs (miRNA)是一种作为基因表达的转录后调节因子的小RNA。最近有研究表明一些miRNAs能够作为致癌基因或肿瘤的抑制物。本研究就旨在评估miRNA表达和临床胃癌患者情况的潜在联系。

【实验设计】 将21位胃癌Ⅲ期，并且经过化疗和外科切除患者的石蜡肿瘤组织切片，用实时定量PCR的方法检测250种人类成熟miRNAs的表达情况。我们通过分析包含其他24位患者在内的数据，确定了与不患病和总生存时间相关的miRNAs。我们还做了体外的细胞增殖和放射敏感度的实验来支撑临床数据。

【结果】 实验结果表明，miR-451的下调与错误预后相关。miR-451通过上皮细胞原位杂交的方式检测，并且在胃癌和直肠结肠癌中，和肺肿瘤组织相比，都表现出下调。在胃癌和直肠结肠癌细胞中过表达miR-451能够减缓细胞增殖，并提高对化疗的敏感度。微阵列和生物信息学分析表明新的致癌基因，巨噬细胞游走抑制因子可能是miR-451的潜在靶标。实际上，过表达miR-451能够在mRNA和蛋白水平上下调巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的表达，并且降低MIF靶向报告基因的表达。我们还在胃癌组织活检中，发现miR-451和MIF表达存在显著的负相关。

【结论】 以上发现说明了miR-451能作为肿瘤增殖的调控因子，并且为抗化疗癌症的有效治疗提供了新思路。

1. 引言

小RNA (miRNA)是近年来发现的一类能作为基因表达负调控因子的，短非编码RNA。miRNA能通过促进mRNA降解或抑制翻译来调控靶基因。进来研究表明miRNA能调控细胞生长、凋亡和分化等多种细胞进程。此外，不同的癌症类型表现出不同的miRNA表达图谱，一些miRNA被认为在肿瘤发展或抑制中发挥一定作用。

miRNA正逐渐被看作是人类肿瘤的调控分子，将miRNA的表达量作为诊断、预后和药物基因组学也是最近新兴的研究方向。据研究，miRNA图谱与几种白血病以及肺癌、乳腺癌和胰腺癌的临床结果相关。这些数据表明，miRNA参与致癌作用并且与预后相关。

在西方国家，胃癌患者通常在临床晚期才被诊断出来，通常表现为淋巴癌扩散，并且预后性差，5年存活率小于30%。根治性外科手术后的化疗是局部晚期肺癌的标准治疗方法。尽管对肿瘤的治疗已有了很大的进步，但是复发率却仍然很高。基于临床和分子预后因子鉴别出可能患病的高危人群是一个日益火热的方向。确定胃癌进程中分子标记物的一个很有前景的策略是关注与患者存活相关的miRNA。

经福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本是临床上最易获得的研究材料。它们通常都有着详细的临床病例记录，并且为分子预后标志物的鉴定提供了宝贵的资源。但是，由于从这种样本中提取的mRNA质量较差，所以还没有广泛用于分子生物学中。研究表明，与组织的加工和储存有关，miRNA比mRNA更不易降解， 因此，经过福尔马林固定、石蜡包埋的样品是研究miRNA的良好材料。

本研究的目的是，确定患者的人胃癌组织中miRNA的表达情况，患者手术后经5-氟尿嘧啶化疗，样本则是经石蜡包埋的。然后，我们将miRNA的表达和临床结果结合起来，确定了miR-451的下调和较差的预后相关。功能实验也表明，过表达miR-451时，人胃癌和结肠癌细胞的增殖减缓，对电离辐射的应答增强，故miR-451能够作为这些癌细胞中的一种新的抑制基因。在观察中，我们还发现miR-451能下调一种参与恶性转化和肿瘤进程的促炎性细胞因子，MIF的表达。

2. 材料方法

3. 结果

3.1 胃癌患者的miRNA表达图谱与临床结果相关

我们分析了21位胃癌Ⅲ期，并且经过化疗和外科切除患者的石蜡肿瘤组织切片，用实时定量PCR的方法检测250种人类成熟miRNAs的表达情况。首先，我们用K平均算法将miRNA的表达量分类。我们观察到miRNA在所有被分析的胃癌样本中的表达是一致的。miRNA的表达量可以分为四组，分别是高、中等、低和无法检测。第一簇包括了一组74条miRNA，它们的Ct值很低，也就意味着表达量很高。Volinia et al.的研究发现了胃肿瘤组织中22条被上调的miRNA，而其中有14条属于第一簇，这表明我们使用福尔马林固定、石蜡包埋的样品，和之前使用冷冻组织样品相比，效果也是很好的。在我们的miRNA群组中，miR-21和miR-24的表达量最高。之前也有研究表明，在胃癌等其他几种癌症中，miR-21的表达量都有提高。第一簇也包含了miR-17-92家族的一些成员(miR-17-5p,

miR-20a, 和miR-92)，而这些都与潜在的致癌行为相关。

之后，我们探究了250条miRNA表达量和无病生存（DFS）率之间的关系。单变量COX比例风险模型分析表明其中两条miRNA(miR-451和miR-126)和患者的DFS有关。这两条miRNA表达量更低的患者比高表达量患者的预后性要更差。

kaplan-meier生存分析也表明，miR-451和miR-126表达量更低的患者，比那些表达量更高的患者，DFS的时间更短。然而，两组患者的DFS的差异只在miR-451表达上有显著性差异(P = 0.008; 时序检验)，因为miR-126的表达量的差异没有统计学上的显著性(P = 0.096; 时序检验)。

为了证明我们的结论，我们进行了实时定量PCR来量化miR-451相对于U6小核RNA的表达水平。实验结果表明：体内miR-451表达量较低的患者，DFS时间更短(P = 0.001)，总存活率也更低(P = 0.003)。此外，多变量比例风险模型分析表明，miR-451表达量低是一个不利的独立因素(P = 0.001)。除了前面利用的21位确定的Ⅲ期患者，我们还加入了24位Ⅰ期和Ⅳ期的患者。我们将这些样本一起进行分析，来评估miR-451的表达是否能作为DFS(P = 0.009)和总存活(P = 0.029)的潜在标志物。多变量分析表明，miR-451的低表达是短DFS的一个不利的独立因子(P = 0.003)。

尽管还需要进一步的前瞻性对照试验，来证明miR-451的确能作为一种预后的分子标记物，我们的实验还是初步证明了miR-451能够在胃癌的预后中表现出重要的作用。

3.2 miR-451在初期胃癌和直结肠癌中下调

为了进一步验证迄今发现的，miR-451在人类胃癌发生中的生物学作用，我们利用实时定量PCR的方法，来比较正常组织和胃癌组织中miR-451的表达量。如附录中Fig. S2A所示，miR-451在78%的胃癌组织中都有下调。

此外，我们还检测了是否miR-451的下调与其它消化道肿瘤相关。我们发现miR-451在所分析样本中75%的直结肠癌中也有下调，这表明这条miRNA的表达在不同的肿瘤中发挥了相关作用。

3.3 上皮细胞中miR-451的检测

miR-451 在成熟红细胞中表达量很高，但是目前还没有研究发现期在胃部或结肠细胞中的表达。胃部原位杂交的结果表明，miR-451在正常分泌腺体的上皮细胞胞质中有表达(Fig. 2A和B)。此外，一些与含氧细胞形态一致的胃底腺细胞中也检测到了miR-451的表达(附录Fig. S3A和B)。我们还发现在成熟红细胞中miR-451有大量的表达，这也与我们预期的一致(附录Fig. S3C)。使用置乱探针结果显阴性表明了这种方法具有特异性(Fig. 2C; 附录Fig. S3B和D)。此种方法中，我们利用RNAU6B的核表达量作为阴性对照。

3.4 miR-451调控化疗后细胞的增殖与存活

miR-451在上皮细胞中表达，在胃癌和结直肠癌细胞中有所下调，这表明miR-451的过表达对于肿瘤来说可能是不利的。miR-451对胃癌和结直肠癌细胞的影响通过过表达miR-451前体分子(pre–miR-451)来检测，pre–miR-451能够经加工，模拟内源性成熟miRNA。miRNA的过表达利用RT-PCR的方式来检测(附录Table S2)，结果表明转染pre–miR-451组的miR-451表达量与丰富的内源性miRNA表达水平相似。

我们首先通过MTS细胞活力测定的方法，检测miR-451的异位表达在胃癌细胞AGS和结直肠癌细胞DLD1细胞系中是否具有生物学效应。转染pre–miR-451的细胞系与那些转染了阴性对照的细胞相比，新陈代谢活跃的细胞数有明显的减少(Fig. 3A)。此外，这条miRNA在细胞增殖方面的异位表达情况也通过集落形成实验进行了测定。用pre–miR-451转染的两种癌症上皮细胞系，和对照相比，六天后，细胞增殖能力降低了50% (Fig. 3B)。

肿瘤细胞中生存通路的异常活化能增强对治疗的抵抗。为了探究miR-451在肿瘤细胞存活和化疗应答中的作用，分别向胃癌细胞AGS和结直肠癌细胞DLD1中转染miR-451的前体分子，然后用MTS和集落形成的方法检测细胞对化疗的敏感度。如Fig. 4A所示，化疗后七天，转染pre - miR-451的细胞MTS检测的增殖率低于对照组细胞。而且，化疗十天后，通过集落形成方法，发现转染pre - miR-451细胞与对照组相比集落形成能力也降低了(Fig. 4B 和 C)。由此可以得出结论，我们的数据表明miR-451的过表达降低了细胞增殖能力，并且使得胃癌和结直肠癌细胞对化疗的敏感度升高。

3.5 miR-451靶标的确定

我们想要探明miR-451在胃癌和结直肠癌中发挥作用的分子机制。我们假设miR-451能够下调靶基因的表达，而靶基因能够引起细胞增殖和对化疗产生抗性。为了确定miR-451的靶基因，我们在向胃癌细胞AGS中转染pre - miR-451后，进行了mRNA表达图谱的测定。通过微阵列分析，对应的93个探针的73个基因的表达，在转染pre - miR-451的胃癌细胞AGS中，与对照组相比，表现出至少两倍的下降。对这些基因的3rsquo;UTRs进行生物信息学分析，确定了有33条基因拥有至少6条与miR-451种子序列互

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