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加压热水萃取褐藻（Saccharina japonica）水解产物的化学组成评价及分析

Periaswamy Sivagnanam Saravana , Jae Hyung Choi, Yong Beom Park, Hee Chul Woo, Byung Soo Chun

Department of Food Science and Technology, Pukyong National University, 45 Yongso-ro, Namgu, Busan 608-737, Republic of Korea

Department of Chemical Engineering, Pukyong National University, 365 Sinseon-ro, Namgu, Busan 608-737, Republic of Korea

关键词：

氨基酸 甘露醇 重金属 美拉德反应产物 加压热水提取 食用海带

摘要：

在本次研究中，以加压热水萃取（PHWE）处理海带，在温度介于180°C–420°C，压力介于13bar和520bar之间的条件下，对水解产物的产率、总有机碳（TOC）、pH值、美拉德反应产物、粘度、颜色、氨基酸、矿物质和单糖含量的测量。随着温度的升高，提取率增加，并且总有机碳含量在72.21%至98.91%之间、pH值、钾和钠含量增加，但是随着温度的升高，粘度降低。必需氨基酸，如缬氨酸和赖氨酸，非必需氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和酪氨酸在低温下恢复良好，水解产物中砷、镉、汞和铅含量最低。总氨基酸含量为180°C/13bar（761.95plusmn;14.54mg/g）、葡萄糖（6.70g/L）、果糖（8.40g/L）和甘露醇（17.50g/L）在180°C/13bar下均能升高。

结果表明，加压热水萃取的食用海带具有良好的工业应用前景，并可作为人类食品。

1.简介：

食用海带（Dashi kombu），褐藻科（褐藻），一种海带或海藻，广泛分布培养于在中国、日本和韩国，它是一种以工业为导向的物种。海带，又称“Kombu”（在中国叫“海带”，在韩国叫“Dasima”，是日本人民饮食的重要组成部分。它是采用一种把海带种子挂在绳子上然后移植到海中的简单耕种技术进行大面积耕种的。近期人们对来自于硫酸化的褐藻中的褐藻多糖进行了研究，研究它们的结构和功能材料[1]。最近的一项研究表明从褐藻中提取的多糖主要是岩藻糖、半乳糖和硫酸盐以及少量其他单糖[2]。海带中的海藻多糖硫酸酯，因为它们不同于普通的多糖，主要含有硫酸岩藻糖。这些硫酸化半乳糖具有广泛的生物功能特性[3]。近期的报告主要是关注藻类物种，因为它们作为营养来源的潜力以及营养特性，包括脂肪酸的组成[4]，氨基酸[5]和膳食纤维[6]都是很重要的。对于服用的具有强身健体作用海草的数量也有相应报道[7]。

水是一种全球通用的中性溶剂，在室温下无毒，随着水分子的临界温度和压力改变，会产生所谓的超临界水，决定水能否表现为有机溶剂和酸性介质[8]。由于这种情况的改变，一些超过临界点(温度为374°C)的水的物理性质和压力会随之改变。它是一种环保的处理剂还可以从各种样品中提供更大的萃取率[9]。高压热水抽提是通过将沸水温度(从100°C提高到374°C)再加一个压力（通常从10升至60bar），以维持水的液体状态后进行抽提[10]。研究的关键因素是不同类型的提取程序会产生不一致的随温度变化的介电常数。在室温下，水是极性溶剂，它的介电常数是80，但是当水被加热到250°C时，介电常数会发生显著的变化，数值变为27，但可以通过保留一个来维持液态合适的压力。该设备可以附加一个冷却装置，用于本机产品的快速冷却，可立即获得加压热水萃取产物[11]。生物量的加压热水萃取有几个与传统工艺(酸、碱、酶)相比更大的水解优势，它的主要优点是不使用有机食品溶剂，这是一个非常重要的因素，因为在任何一个过程中，有机溶剂必须回收，焚烧，或提交给一个适合统一操作机构，否则会造成非侵略性的浪费和环境问题[12]。它不需要生物质预处理，操作简便快捷，比起常规水解方法表现出较小的腐蚀，较低的残留产生，和较低糖降解[13]。

另一方面，据报道，在加压热水萃取期间的海带会生成褐变化合物[14]，是通过美拉德反应的羰基反应生成了一种含有游离氨基酸的还原糖产品(MRPs)。这是在草药和食品中都被鉴定为有用的抗氧化剂。特别是抗氧化活性增加后具有较强的加热强度，在水解过程中与彩色显影相近，而MRPs负责大部分的抗氧化活性[14]。因此，它将是很有价值的测量MRPs水平变化的方法。

因此，本研究的目的是计算加压热水萃取的使用情况并用不同的温度来鉴别化学成分总有机碳(TOC)、pH、MRPs、粘度、颜色、氨基酸、矿物质和单糖的含量。我们的研究结果得出的海带营养成分是否与加压热水萃取相关，被认为在发酵工业中对人类健康有很大作用。

2.材料和方法

2.1材料

褐藻海带（S. japonica, J.E. Areschoug, 1851, Lane, Mayes, Druehl, and Saunders），是从格米埃普，万多冈，全罗南道，大韩民国等地区收集来的。高纯氮气由KOSEM(大韩民国洋山)供应。所有的试剂用于分析或高效液相色谱，半乳糖，葡萄糖，果糖，阿拉伯糖，甘露糖，甘露醇、山梨醇、木糖醇、木糖标准品(纯度n98%)购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯)。

2.2样品制备

新鲜的海带样品用清水冲洗，把不用的材料连带着样品上附着的盐和矿物质洗净，再将样品切成小片。切片后在- 80℃配有方形干燥室的冷冻干燥机下干燥3天，干燥完成将样品收集起来并放入密封塑料袋。然后用机械搅拌机将样品磨细后，通过孔径为710-mu;m的不锈钢筛网进行筛分。

2.3加压热水萃取（PHWE）

PHWE是在用Hastelloy C276 (连续型超临界水系统，南韩)制造的体积为200立方厘米的反应器中进行的，反应器带有温度控制装置(图1)。取6克样品材料，加入150毫升蒸馏水装入反应器。然后将容器封闭，用电加热器加热至某个温度(180°C - 420°C)。反应器内压力是根据确定的饱和蒸汽的基础为13bar和520bar之间的瞬变电磁法温度范围进行了研究的。反应堆里的温度和压力使用温度控制器和压力计分别进行控制。样品以每分钟150转的速度搅拌，达到理想温度后，维持反应5分钟。反应后收集水解产物样品，冷却达到室温(停止反应后1 - 2小时内)，使用绘画纸尼龙膜过滤器(0.45mu;m)过滤，并储存在4°C的环境内。PHWE干燥后回收的残余样品，它们的重量以克(g)为单位。

图1 加压热水抽提(PHWE)流程图

2.4萃取率

根据实验结果计算了萃取率[15]。计算萃取率公式如下：

萃取率（% ）=干提物重/初始干样重

海带水解液在120℃的烘箱中保存24小时得到的是干提物的重量，和初始的干样重量通过减法计算了冻干海带的产物水含量与总重。冻干的海带在120°C的烤箱中干燥24小时后一式三份。海带在冷冻干燥后水分含量的百分比为10.69plusmn;0.64%。

2.5总有机碳

测定了海带水解液的总有机碳含量取决于TOC-Vcph, SSM(岛津)的使用。这个实验进行分析时每个条件下均使用1000ppm的水解水。

2.6 pH值测量

食用海带水解液的pH值测量是使用梅特勒托莱多pH计在20°C的温度下测量。测量前的措施是使用技术缓冲溶液对pH计进行校准pH值分别为4.01plusmn;0.02、7.00plusmn;0.02和9.2plusmn;0.02。

2.7 用吸光度法测定MRPs

食用海带水解物褐变强度的测定使用MRPs(类黑色素)。通过这些萃取物在360 nm和420 nm时的吸光度直接测定褐变强度。它表示为任意吸光度单位(a.u) [14]。

2.8 粘度测量

使用布鲁克菲尔德DVIota;Iota; 职业粘度计(布鲁克菲尔德工程实验室，托利公司，美国马州米德尔伯勒) 按所述方法测定制备的食用海带水解液的粘度制备[16]。总共取8毫升0.1% (w/v)的样品置于一个容器里并在0.1M醋酸溶解后，25°C培育10min。主轴SC4-18在转速为150 rpm时搅拌，然后用于测量粘度，用厘泊(cP)表示。

2.9 测色仪器

使用美能达CM-2600d的色彩空间带光源D65,10°环境观察，SCI模式，并使用11毫米口径用于照明的仪器和8mm用于测量的仪器，在CIELab(色彩空间)中研究食用海带水解液的颜色。较低反射率玻璃(Minolta CR-A51/1829-752)被放置在样品和设备之中。下列颜色坐标协调采自:明度(L*)，红度(a*，plusmn;红-绿)，黄度(b*，plusmn;黄-蓝)。由这些坐标，色调 (H*)和浓度 (C*)计算方法如下:

色调= 浓度=

2.10 氨基酸组成分析

取6N食用海带样品(400mg)水解在含有0.1%苯酚(用于保护酪氨酸)的安瓿中的盐酸中，在110℃下保存24小时。酸水解后，加入30毫升柠檬酸盐加入缓冲液(pH 2.2)，调节pH在0.5 ~ 1之间使用7.5N NaOH，调节PH在2.2时使用1N NaOH。得到的样本稀释至100毫升，添加1毫升檬酸缓冲的50mu;M去亮氨酸溶液(作为内标)，而海带水解后进行PHWE过滤(0.22mu;m醋酸纤维素)并装入S430 (SYKAM)氨基酸自动分析仪用于游离氨基酸分析。阳离子分离柱LCA K07/Li (4.6times;150mm)，柱温37°C - 74°C，缓冲液游离氨基酸分析pH值为2.90-7.95。的流动相为5 mM对甲苯磺酸溶液a流速为0.45 mL/min。5毫米对甲苯磺酸盐的混合物以酸性、20mm双三酸、100mm EDTA作为对照柱后试剂流速为0.25 mL/min。激发和发射波长分别为440 nm和570 nm。分别在0.1 M中制备氨基酸原液盐酸;在水中制备色氨酸[17]。

2.11 矿物鉴定

制备了海带水解液和冻干样品，正如Rochaetal所描述的，做了一些小小的修改[18]。水解物的过滤是使用0.45mu;m注射器过滤器(Sartorius),立即用HNO3酸化至pH小于2，并储存在预先用10%的HNO3清洗过的(漂洗过的)容器中，然后用MilliQ水冲洗高密度聚乙烯瓶。过滤是在测量之前进行的，目的是为了去除样品中存在的微小物PerkinElmer Elan 6100

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