蛹虫草提取物对氧化应激诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡及早衰的保护作用外文翻译资料

 2022-08-06 11:08

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蛹虫草提取物对氧化应激诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡及早衰的保护作用

摘要

活性氧化应激是活性氧类衰老和疾病等退行性疾病的主要原因。在这项研究中，我们研究了蛹虫草提取物(CME)是否在体外对过氧化氢诱导的人皮肤成纤维细胞(HDFs)的氧化应激有保护作用。结果表明，2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)清除自由基的能力呈剂量依赖性增强。我们发现，与对照组相比，HDFs中的过氧化氢处理增加了活性氧的产生和细胞死亡。然而，CME通过抑制细胞内活性氧的产生，提高了HDFs对过氧化氢诱导的氧化应激的存活率。CME治疗抑制过氧化氢诱导的HDFs细胞凋亡和凋亡核凝结。此外，CME抑制了过氧化氢诱导的sa-半乳糖阳性细胞，提示CME可抑制氧化应激诱导的早衰。因此，这些结果提示CME可能通过清除活性氧而对氧化应激诱导的早衰具有保护作用。

关键词: 蛹虫草; 细胞凋亡; 成纤维细胞; 氧化应激; 衰老

Cordyceps militaris Extract Protects Human Dermal Fibroblasts against Oxidative Stress-Induced Apoptosis

and Premature Senescence

Abstract

Oxidative stress induced by reactive oxygen species (ROS) is the major cause of degenerative disorders including aging and disease. In this study, we investigated whether Cordyceps militaris extract (CME) has in vitro protective effects on hydrogen peroxide-induced oxidative stress in human dermal fibroblasts (HDFs). Our results showed that the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of CME was increased in a dose-dependent manner. We found that hydrogen peroxide treatment in HDFs increased ROS generation and cell death as compared with the control. However, CME improved the survival of HDFs against hydrogen peroxide-induced oxidative stress via inhibition of intracellular ROS production. CME treatment inhibited hydrogen peroxide-induced apoptotic cell death and apoptotic nuclear condensation in HDFs. In addition, CME prevented hydrogen peroxide-induced SA-beta;-gal-positive cells suggesting CME could inhibit oxidative stress-induced premature senescence. Therefore, these results suggest that CME might have protective effects against oxidative stress-induced premature senescence via scavenging ROS.

Keywords: Cordyceps militaris; apoptosis; fibroblast; oxidative stress; senescence

1.引言

皮肤老化可以分为内在老化(时间老化)和外在老化(外在老化)，前者是影响所有身体器官的衰老过程，后者是由于暴露于阳光(光老化)、吸烟和干燥等环境因素造成的[1-3]。其中一个最重要的外在衰老因素是阳光，特别是暴露在紫外线照射下，这会在人体内产生细胞内活性氧类，从而导致皮肤衰老[4]。过多的活性氧如羟基自由基(-OH)、超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)在细胞中产生，导致细胞内稳态的破坏，氧化应激，最终导致器官中细胞的破坏。“衰老的自由基理论”指出，细胞功能的进行性缺陷导致活性氧的产生增加，而活性氧在衰老过程的开始和进程中起着重要作用[6]。氧化应激诱导的成纤维细胞早衰最近被认为是不可逆生长抑制拥有属性衰老特异性细胞形态和酶表达的一种解释[7]。暴露于过氧化氢中的早衰细胞呈现出一种复制性衰老细胞的状态，如大的扁平形态和增加衰老相关的半乳糖苷酶(sa-gal)活性[8,9]。直接接触氧化剂，如过氧化氢或紫外线辐射可直接诱导细胞凋亡[10,11]。此外，有研究表明，活性氧累积在人体皮肤的光老化过程中发挥着重要作用，而且据报道，活性氧引起各种皮肤炎症性疾病和皮肤癌[12]。因此，消除细胞内活性氧对疾病的防治具有重要意义。

冬虫夏草真菌是一种寄生的真菌复合体，几个世纪以来，特别是在韩国、中国和亚洲国家，冬虫夏草被用于医疗目的。蛹虫草是一种虫生真菌，隶属于子囊菌纲，具有良好的生物活性。特别是多糖被认为是蛹虫草的主要活性物质之一，具有多种生理活性，已用于降血糖、降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗转移、免疫调节和抗氧化等多种药用。近年来，许多化妆品和护肤品都补充了天然产品，包括蘑菇，已经引起了广泛关注[19,20]。然而，对于过氧化氢诱导的HDFs细胞凋亡和早衰的预防作用尚未见报道。

在本研究中，我们评价了蛹虫草热水提取物对过氧化氢诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡和早衰的预防作用。

2.材料和方法

2.1.材料

从美国纽约州格兰德岛的GIBCO分离得到杜氏改良鹰氏培养基(DMEM)、青霉素g、链霉素和胎牛血清(FBS)。过氧化氢，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴(MTT)，2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)和Hoechst 3342从Sigma Biochemicals(st.Louis，MO，USA)购得。2′，7′-二氯二氢荧光素双乙酸酯((H2DCFDA)和凋亡分析试剂盒购自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的分子探针公司。所有其他的化学品都是从Sigma购买的。

2.2.蛹虫草提取物的制备

以600ml蒸馏水在121c条件下提取20g的蛹虫草子实体。将提取物以5000转/分钟的速度离心20分钟，然后用0.45 mu;m的沃特曼滤纸(梅德斯通，Whatman有限公司)过滤，除去不溶性物质，然后冷冻干燥。所得蛹虫草提取物(CME)保存在-20°c，直至用于活性评价。

2.3.细胞培养

人真皮成纤维细胞(HDFs)购自美国类型培养收集(马纳萨斯，VA，美国)。在DMEM培养基中加入10%热灭活FBS、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100 mu;g/ml链霉素。细胞在5%CO2培养箱中保持在37°c。用0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25%)提取细胞，接种于DMEM培养基中48小时。在这项研究中，使用的细胞是从4到10的早期传代。

2.4.DPPH自由基清除活性

采用DPPH法对CME进行了抗氧化活性测定[21]。将不同浓度(10ー500 mu;g/ml)的CME加入到最终的100ml乙醇溶液中。反应混合物摇动30min，在520nm处测定残留DPPH含量。DPPH自由基清除活性(%)计算如下:

[(optical density of DPPH radical treatment) minus; (optical density of CME DPPH radical treatment)]/(optical density of DPPH radical treatment) times; 100

2.5.细胞活力分析

为了确定CME的细胞毒性效应，采用MTT法测定了经过过氧化氢处理的HDFs的细胞活性。Hdfs((2 times; 104 cells/Ml)在12孔培养板上接种，培养48h后，加入不同浓度(10ー500mu;g/ml)的CME。24h后，MTT法检测活细胞数。为了研究CME对过氧化氢诱导的细胞死亡的保护作用，在12孔板上接种了HDFs。培养48h后，用不同浓度的CME处理细胞4h，然后每个细胞增加0.8mM的CME过氧化氢。经过3小时的培养，加入0.5mg/ml的MTT溶液，然后进一步培养3小时，在每个孔中的Formazan晶体在异丙醇中溶解，在570nm处测定吸光度。

2.6.细胞内活性氧清除活性

用氧化敏感荧光探针测定细胞内活性氧(ROS)的产生，H2DCFDA被细胞内酯酶切割成非荧光形式的DCFH。这种形式，不再是膜可渗透，可以进一步被过氧化氢氧化成它的荧光形式，DCF。为了研究CME对氧化应激的影响，HDFs(2.5104cell/well)被种植在12孔板中，并在37°c孵育以允许细胞附着。48h后，加入或不加入CME处理4h，然后在平板的每个孔中加入0.8mM的过氧化氢。3h后，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入5mH2DCFDA溶液，用微板荧光光谱仪测量激发波长和发射波长分别为485nm和535nm的荧光。为了进行细胞内活性氧产生的图像分析，将HDFs(2.5104cell/well)种植在装有六孔板的覆盖板中，并用上述方法处理。将H2DCFDA溶液加入平板的每个孔中，在37°c温度下培养2小时。然后用3.7%的多聚甲醛固定细胞20min，用PBS洗涤。用PBS清洗后，用vectasshield(布伦施韦格，荷兰)将细胞安装在玻璃罩下。染色细胞的图像是用荧光显微镜收集的(日本东京，尼康)。

2.7.测量DNA凝聚 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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