固相还原氨化法在糖类分析中的应用外文翻译资料

 2022-06-16 09:06

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固相还原氨化法在糖类分析中的应用

Kuan Jianga, b, He Zhub, Cong Xiaob, Ding Liub, Garrett Edmundsb, Liuqing Wenb, Cheng Mab* , Jing Lia**, Peng George Wanga, b***

a南开大学药学院药物化学生物学国家重点实验室，天津市分子药物研究重点实验室，天津300353

b佐治亚州立大学化学系，美国，乔治亚州，亚特兰大30303

*通讯作者，**通讯作者，***通讯作者。

南开大学药学院药物化学生物学国家重点实验室，天津药物分子药物研究重点实验室，天津300353

创新点：

●固相还原氨化法使用非多孔石墨化碳作为吸收剂显示出高效率的标记。

●固相还原可以简单、快捷、经济的还原氨化聚糖。

●与溶液中的还原氨化反应相比，固相还原的方法能够将样品的回收率提高20~30%。

●固相还原氨化法可用于同位素示踪，并可以与泛甲基化法兼容。

文章信息：

文章历史

于2016年10月30日收到

于2017年1月2日以以订正形式收到

于2017年1月13日接受

于2017年1月31日可在网上查看

关键词：还原氨化，糖分析，无孔石墨化碳，相对定量，固相方法

摘要图：

摘要：还原氨化法是聚糖分析中一种不可缺少的方法，这种方法极大的促进了通过对聚糖还原末端进行标记来对聚糖进行定性定量分析。然而传统的溶液中的衍生方法基于制备还原氨化的多糖的方法，相当乏味和费时。这里提出固相还原氨化的方法，这是一种更加简便，更有效率的方法。这种新方法的基本概念是简化聚糖提取、衍生，并在无孔石墨化碳吸附剂上纯化，并且使用中性和唾液酸化的标准聚糖来测试固相的可行性。结果得出，用四种常见的标记试剂苯胺，2-氨基苯甲酰胺（2-AB），2-氨基苯甲酸（2-AA）和2-氨基-N-（2-氨基乙基）-苯甲酰胺（AEAB），几乎可以完全标记这些聚糖，在样品制备期间发生唾液酸化可忽略。高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析显示，对糖蛋白中的聚糖进行标记具有良好的重现性。将荧光吸收和使用同位素标记进行定量分析进行直接比较得到，固相反应的方法使得样品回收率增加20~30％。简而言之，固相反应的方法简单，重现性好，高效并且对聚糖分析十分灵敏。该方法在MALDI-TOF MS上也成功应用于的HEK 293细胞中的N-聚糖分析，显示出其在哺乳动物聚糖的分析中有广泛的应用前景。

  1. 介绍

糖基化是蛋白质翻译后修饰的（PTM）重要方式之一。细胞中糖基化的主要作用被确定为信号传导，细胞粘附，免疫反应和疾病进展[1-4]。因此建立一种能够聚糖确定所有聚糖种类的身份和数量的能力分析方法显得十分重要。同时，简化步骤，缩短操作时间，提高样品制备过程中的回收率对于蛋白质糖基化进行的准确，高灵敏和可重复的分析是必不可少的。聚糖分析的主要技术包括色谱法，电迁移法和质谱法。然而，由于聚糖光学性能以及电离效率差，天然聚糖在光学或质谱检测中强度较低[5,6]。为了解决这些问题，前人已经大量报道过聚糖衍生化策略（例如全甲基化，迈克尔加成和酰肼标记）[7-9]，并且其中最广泛应用的是还原氨化法，其将还原糖末端用含伯胺标签标记，例如苯胺，2-氨基苯甲酰胺（2-AB），2-氨基苯甲酸（2-AA）和2-氨基吡啶（PA）[10]。这种方法的一个优点是与聚糖进行等量标记，允许基于荧光/紫外吸收直接定量分析不同的聚糖。对于质谱分析，一些衍生剂可以使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和/或电喷雾电离（ESI）来提高聚糖的电离效率[11]。带有标记的还原末端，还原氨化聚糖也在串联MS中产生明确的片段，促进了聚糖的结构测定。此外，还原氨化用于成对引入各种同位素标记的底物如12[C6]-/13[C6]-苯胺，d0-/d5-苯胺和12[C6]-/13[C6]，基于MS进行不同样本比较[12-14]。还原性氨化也可以通过多种标记物标记聚糖，例如2,6-二氨基吡啶（DAP）和2-氨基-N-（2-氨基乙基）苯甲酰胺（AEAB）用于聚糖分离和固定在微阵列[15,16]，十七氟十一胺（HFUA）上进行聚糖纯化和灵敏检测[17]。然而，从糖蛋白中还原氨化聚糖的常用策略是非常繁琐且耗时的，其涉及化学或将糖蛋白的聚糖进行酶切，从释放的聚糖中去除蛋白质，盐和表面活性剂，聚糖衍生化以及清除的衍生聚糖。将聚糖衍生的步骤简化，对于聚糖分析是非常有价值的。例如，采用丙酮沉淀法快速纯化衍生后的同位素苯胺标记的聚糖[18,19]；通过使用羧基包裹的磁珠实现了用于毛细管电泳（CE）分析的1-氨基芘-3,6,8-三磺酸（APTS）标记的聚糖的检测[20,21]。然而，鉴于由各种功能性标签产生的还原性氨化的许多益处，需要一种适用于不同标签的更通用的方法。

固相法技术具有快速简便，回收率高的优点，已被广泛应用于化学合成，样品提取和衍生化[22-24]。对于糖基化分析，固相萃取（SPE）通常用于聚糖纯化，因为它是高效的并且可以适应高通量设置。无孔石墨化碳（NPGC）的固定相提供了独特的分离机制，基于分析物-流动相和分析物-石墨表面之间的分散相互作用以及极性分析物与石墨的可极化表面之间的电荷诱导的相互作用[25]。低聚糖作为极性化合物可以有效地吸附在NPGC表面，并通过改变流动相进行分离。据报道，从吸附剂中完全回收天然和酸性低聚糖是可能的[26]。在反相（RP），亲水相互作用液相色谱（HILIC）和阴离子交换色谱等不同的固定相中，NPGC是非衍生化聚糖纯化最广泛和最初应用的，其与还原氨化聚糖的使用也已报道[27-29]。萃取和化学反应对固相形式的顺序应用于生物技术过程，包括多肽和寡核苷酸合成和测序的自动化，重现性和效率至关重要[30-33]。考虑到这些应用，我们提出将天然糖链的纯化，聚糖衍生化和标记的聚糖纯化结合在一个NPGC柱上。即通过苯胺，2-AA，2-AB和AEAB四个常见的标签验证这一策略的可行性。通过固相还原氨化将糖肽，糖蛋白和复杂生物样品的标准聚糖和聚糖进行衍生。采用HPLC-FLD和MALDI-TOF MS分析衍生产物，并且将该方法与溶液中的还原氨化法进行比较。此外本文还研究了固相还原氨化与同位素标记和全甲基化的相容性。

  1. 实验

2.1 实验材料

2-氨基苯甲酰胺（2-AB），2-氨基苯甲酸（2-AA），苯胺，苯胺-2,3,4,5,6-d5，氰基硼氢化钠，2,5-二羟基苯甲酸（DHB），乳糖，麦芽七糖（DP7,90％），牛胰核糖核酸酶B（RNase B），卵白蛋白和牛胎球蛋白均购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）。使用我们的报道的方法从蛋黄中制备唾液酸糖肽（SGP）[34]。根据以前的研究[16]合成2-氨基-N-（2-氨基乙基）-苯甲酰胺（AEAB）盐酸盐。肽-N-糖苷酶F（PNGase F）来自New England BioLabs（Beverley，MA，USA）。Sep Pak C18 SPE柱（100 mg/1 mL）来自Waters（Milford，MA，USA）。无孔石墨化碳（Carbograph）SPE柱（150 mg/4 mL）来自Alltech Associates（Deerfield，IL，USA）。

2.2 细胞培养和收获

HEK293细胞维持在补充有10％胎牛血清（FBS，Gibco）（v / v）的Dulbecco#39;s改良的Eagle培养基（DMEM，Gibco）中，在37 ℃和富含5％CO2的潮湿气氛中。一旦达到约90％汇合，将细胞用冰冷PBS洗涤，悬浮于PBS中，500 g离心5分钟，再用PBS洗涤两次。 按照制造商的说明将收获的细胞在1times;RIPA缓冲液（EMD Millipore）中裂解。 然后在PNGase F消化之前，通过使用Amicon Ultra（0.5 mL，10K截止值）离心管，用含有0.5％SDS和40 mM DTT的100 mM Tris-HCl（pH=7.6）的变性缓冲液替换裂解缓冲液。

2.3 制备聚糖样品

Gal1Man3GlcNAc4，alpha;2,3-和alpha;2,6-唾液酸化的LacNAc的标准聚糖根据我们先前的报道用化学方法合成[35,36]。为了释放N-聚糖，将200 mg RNase B，200 mg卵清蛋白，20 mg SGP，200 mg牛胎球蛋白和1times;106 293T细胞分别溶解在200 mL变性缓冲液中，并在90 ℃加热10分钟。在各样品中加入20 mL 10％NP40（v / v）和50 U PNGase F后，将反应混合物在37 ℃下温育过夜。为了去除去糖基化的蛋白质，将消化物加载到用5 mL乙腈（ACN）和5 mL在0.1％TFA中的5％ACN / 95％H2 O预处理的SepPak C18 SPE柱上。用5 mL在0.1％TFA中的5％ACN / 95％H2O洗脱聚糖。

2.4 聚糖的溶液内还原氨化

将来自SepPak C18 SPE的洗脱液装载到NPGC柱上并用6 mL ACN预处理，并用6 mL在0.1％TFA中的5％ACN / 95％H2O平衡的NPGC柱脱盐。将样品用12 mL在0.1％TFA中的5 mL ACN / 95％H 2 O洗涤，用4 mL在0.1％TFA中的25％ACN / 95％H2O洗脱，并冻干。对于溶液内标记，将干燥的寡糖溶于100 mL含有0.35 M衍生试剂和1 M氰基硼氢化钠的70％DMSO / 30％乙酸中，并在65 ℃孵育1小时。用1 mL水淬灭反应，并使用与上述相同的程序通过NPGC柱提取并纯化标记的聚糖。 在SPE柱中，标记的聚糖用4 mL在0.1％TFA中的40％ACN / 60％H2O洗脱。

2.5 固相萃取，还原氨化和纯化聚糖

对于固相还原氨化，如上文中所述对NPGC柱进行预处理并平衡。将溶解在0.1％TFA中的1 mL 5％ACN / 95％H2O中的标准聚糖或来自含有N-聚糖的SepPak C18 SPE柱的洗脱液加载到平衡柱上，并用6 mL 5％ACN / 95％H2O 0.1％TFA去除盐。 在贴标签之前，筒被抽真空除去水分。将含有0.35 M衍生试剂和1 M氰基硼氢化钠的100 mL DMSO-乙酸混合物（7：3，v / v）的衍生化溶液滴加并渗透到吸附剂中。将柱子两端密封并在65 ℃下孵育1小时。 之后，向柱中加入3 mL水以猝灭反应，收集洗脱液重新洗涤三次，并用12 mL在0.1％TFA中的5％ACN / 95％H2O洗涤柱以除去过量的衍生物药剂和盐。衍生的聚糖用4 mL在0.1％TFA中的40％ACN / 60％H2O洗脱。

2.6 衍生化聚糖的甲基化

通过固体氢氧化钠技术进行甲基化[37]。简言之，用3times;0.5 mL的ACN和3times;0.5 mL的DMSO洗涤1 g的NaOH丸粒以除去水分，研磨并重新悬浮于4 mL的DMSO中。用1 mL的NaOH / DMSO浆液和0.5 mL甲基碘处理冻干的样品10分钟，同时在室温下搅拌。然后通过加入3 mL水终止反应。随后，加入1 mL氯仿，涡旋混合物，然后离心分离。除去上层水层，用4 mL水再次洗涤氯仿层四次。将氯仿蒸发以获得干燥的全甲基化样品，将其再溶解于50％ACN / 50％H2O中用于分析。

2.7 HPLC分析

HPLC分析在CBM-20A系统（Shimadzu）上进行，与荧光检测器（RF-10Axl）结合。固定330 nm激发和420 nm发射的荧光以检测标记的聚糖。对于正相HPLC分离，使用Waters XBridge BEH酰胺柱（130 Aring;，5 mm，4.6 mmtimes;250 mm），梯度运行条件（溶剂A：10 mm甲酸铵，pH=4.5;溶剂B：乙腈;流动速率：1 mL /分钟; B％：在60分钟内75-45％）。分别收集对应于来自HPLC分离的色谱峰的洗脱液级分，并通过MALDI-TOF MS分析。

2.8 MALDI-TOF MS分析

通过MALDI-TOF MS的干液滴法将1 mu;L样品溶液沉积在具有相同体积的DHB（在50％ACN / 50％H2O中10 mg mL-1）的靶板（Bruker Daltonics，MTP

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