一种用于检测活细胞中的半胱氨酸和高半胱氨酸的基于NBD的新型荧光开启探针外文翻译资料

 2022-08-10 04:08

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一种用于检测活细胞中的半胱氨酸和高半胱氨酸的基于NBD的新型荧光开启探针

摘要：半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）等生物硫醇参与许多生物过程，并在生物系统中发挥关键 作用。因此，生物硫醇的检测对于疾病的早期诊断和疾病进展的评估非常重要。本文中，我们开发了一种基于7-硝 基-2,1,3-苯并恶二唑（NBD）的新型开启式荧光探针1，由于亲核取代反应和Smiles重排反应，该探针对Cys / Hcy具有高度选择性和敏感性。该探针可快速检测Cys / Hcy，荧光强度在1分钟内立即增加。此外，该探针是低毒的，并且已经成功地通过细胞荧光成像用于检测活体正常细胞和癌细胞中细胞内Cys / Hcy。

关键词：7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑（NBD）；荧光探针；Cys/Hcy；正常细胞；癌细胞

介绍

半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）等生物硫醇参与许多生物过程，并在维持适当的生物系统氧化还原状态中起关键作用。Cys和Hcy是生物排毒系统、免疫系统以及细胞和组织的生长和衰老所必需的生物分子[1,2].半胱氨酸水平异常可导致生长缓慢、脱发、肝损伤、肌肉和脂肪流失、皮肤病变和癌症等问题[3]。同型半胱氨酸（Hcy）与多种类型的血管和肾脏疾病有关，被认为是心血管疾病和阿尔茨海默氏病的危险因素[4,5]。还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内最丰富的非蛋白硫醇（1–10 mM），是氧化应激的生物标志物[6,7]。现已发现，谷胱甘肽在控制氧化应激中起着至关重要的作用，以维持细胞生长和功能的氧化还原稳态[8]。GSH含量异常与艾滋病、癌症、肝损害和神经退行性疾病等多种疾病相关[9]。更重要的是，许多研究表明，Cys / Hcy和GSH含量是相互关联的[10–13]。GSH被认为是成年大鼠肝脏中Cys的定性细胞储存器[14]。此外，GSH的合成取决于Hcy的反硫作用。因此，生物硫醇的检测对于疾病的早期诊断和疾病进展的评估非常重要。

在已报道的检测方法中，荧光检测由于其简便性、成本低、高选择性和

灵敏性而备受关注。近年来，开发了许多荧光探针来检测和感知这些生物学上重要的物质[15–22]。

相应的设计策略通常基于巯基的强亲核性，并结合了迈克尔加成，环化反应，配位置换，裂解反应等多种机理[15–22]。典型的荧光探针是通过将特定的识别单元整合到经典的荧光团平台中而构建的。各种识别单元已经用于生物硫醇的检测，如醛、丙烯酸酯、2，4-二硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基磺酰基、甲氧基硫酚和二硫化物等[15-22]。因此，我们应当发现和优化原始识别单元同时构建具有改进性能的新型荧光探针。由于嘧啶的亲电性和生物相容性，我们可假设嘧啶-硫醚具有作为识别单位探针用来区分生物硫醇的潜在功能。据我们所知，Tang的研究小组最近报道了一个含嘧啶醚的硫醇探针库[26]，而嘧啶-硫醚从未被研究过构建荧光探针。因此，我们推测应该通过将嘧啶基-硫醚结合到荧光团上来产生用于识别生物硫的新型荧光探针候选物。

由于7-硝基-2,1,3- 苯并恶二唑（NBD）良好的光化学/光物理性质和细胞渗透性，我们已将NBD生色团用于荧光试剂的设计[27–31]。我们的团队对基于NBD的设计和合成非常感兴趣[32-35]，在本文中将4，6-二甲氧基-2-嘧啶基-硫醚结合到NBD染色体中，生成了基于NBD的包含原始识别单元的探针1（方案1)。探针1可以根据Smiles重排反应从 GSH区分Cys / Hcy[36]。由于其高特异性、明显的荧光反应和较低的检测限等可取的特性，探针1已成功地用于活体正常细胞和癌细胞中 Cys / Hcy的荧光成像。

方案 1. 探针1的合成

实验部分

2.1原料和测试

所有试剂均购自商业供应商，无需进一步纯化即可使用。实验所用的溶剂在使用前通过标准方法纯化：色谱纯的二甲亚砜（DMSO）、去离子水。在Varian Model Mercury 400 MHz光谱仪检测1 H NMR光谱，由CDCl3萃取（delta;= 7.26 ppm），1 H NMR化学位移（delta;）从Me4Si低磁场开始以ppm给出（s =单峰，d =双峰，t =三重态，q =四重态，m =多重态）。在Varian Model Mercury 100MHz光谱仪上检测13C NMR光谱。以内部的d6-DMSO为delta;77.0 ppm为标准，以ppm记录13C NMR化学位移（delta;）。紫外可见光谱仪是Shimadzu UV-2350分光 光度计。荧光光谱通过Varian Cary Eclipse荧光分光光度计 测量。使用Agilent 1100系列LC / MSD和AB SCIEX TripleTOFTM 5600 质谱仪获得电喷雾电离质谱（ESI-MS）。除共聚焦激光扫描显微图像外，所有光谱均在室温下记录。

使用以下关系式，计算与Cys反应前后的探针1的荧光量子产率：

Phi;f=Phi;refFsamplAref/FrefAsampl (1)

其中，F表示校正后的荧光光谱的积分，A是激发波长下的吸光度，ref和sampl

分别代表参考样品和未知实验样品的参数。使用的参考系统是Rhodamine B (CH3OH中Phi;f = 0.86 )

2.2Hcy和Cys的感测程序

25°C中，在100％CH3CN中制备探针1的储备溶液（1 mM），然后在CH3CN / PBS缓冲液（体积比3：7 ，10 mM，pH 7.4）将其稀释以制备合适浓度的探针1溶液，每个实验都使用新鲜制备的Hcy（或Cys）储备溶液。在460 nm 处激发，在547 nm处被检测到，激发和发射狭缝宽度设置为10nm。

2.3检测限

基于荧光滴定计算检测限，在没有Hcy（或Cys）的情况下，对探针1 的荧光发射光谱进行了五次测量，并达到了空白测量的标准偏差。为了获得斜率，将547 nm处的荧光强度绘制成Hcy（或Cys）的浓度。因此， 使用下式计算检出限: 检出限=3sigma;/ k （2）

其中sigma;是空白测量的标准偏差，k是荧光强度与Hcy（或Cys）浓度之间的斜率。

2.4MTT检测

活细胞在有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，在37°C下于5％CO2/空气中孵育的活细胞接种到96孔板中，然后在DMEM中分别添加0、5、10、15、20mu;M探针1 （n = 3），未经处理的DMEM也在相同条件下进行分析（n = 3）。接着，将细胞在37℃下孵育12小时。然后， 分离培养基，将10mu;LMTT溶液（5 mg / mL）添加到每个孔中，然后在 37°C下孵育4 h。弃去上清液，将100mu;LCH3CN添加到每个孔中。摇动平板 10分钟后，用酶标仪在490 nm处读取孔的光密度（OD）值。根据等式计算细胞存活率（VR）:

VR = (OD1minus;OD0 )/(OD2minus;OD0 )100% (3)

其中OD1是实验组的光密度，OD2是对照组的光密度，OD0是未处理的测定

组的光密度。

2.5细胞培养和活细胞成像

在37℃中，将活细胞在DMEM中与10％（体积比）胎牛血清，1％青霉素/链霉素在 5％CO2中反应。将活细胞以每孔5times;104个细胞的密度（200mu;L）接种到6孔板中。通过使用共聚焦激光扫描显微镜对细胞成像（lambda;= 460 nm,，ZEISS-LSM-710）。将DMSO中的探针1（5 mM，2mu;L）添加到六室细胞培养板上的活细胞中，该培养板包含1.0 mL培养基，并在37°C下反应20分钟。除去培养基并用PBS洗涤3次后，拍摄细胞的荧光图像。对于对照实验，将含有1.0 mL培养基的六室细胞培养板中的细胞在37°C的潮湿培养箱中用5 mM乙基马来酰亚胺（NEM）在培养基中处理30分钟。用PBS洗涤3次后，细胞将其与10mu;M探针进一步温育20分钟。用PBS洗涤3次后，拍摄细胞的荧光图像。

方案 2针对Cys和Hcy的探针1的提议的感测机制

2.6探针1的合成

将4-氯7-硝基呋喃唑酮（100.0 mg，0.5 mmol）溶于DCM / THF（25/25 mL）和2-巯基-4,6-二甲氧基嘧啶（103.3 mg，0.6 mmol）和 K2CO3（82.9mg，0.6mmol）加入。将反应混合物用氮气吹扫并在室温下搅拌1.5小时。将粗混合物倒入乙醚中，用Na2CO3水溶液洗涤，并将有机层蒸发至干。经硅胶柱色谱法（CH2Cl2/石油醚，体积比3：1）过滤后， 获得为橙色结晶固体的探针1（119.7mg，71.4％）。熔点：209.6– 211.8°C。1 H NMR (400 MHz, d6-DMSO): delta; 8.50 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 5.86 (s, 1H), 3.72 (s, 6H);13C NMR (100 MHz, d6-DMSO): delta; 171.06, 165.81, 150.75, 142.51, 132.41, 132.13, 129.99, 88.10, 54.37;HRMS-ESI ：对于 [C12H9N5O5S] 计算： 336.0397 ；实测值：336.0407。

结果和讨论

3.1. 设计原理

在我们以前的工作中，我们报告了一种基于对甲苯硫酚的NBD型荧光探针来选择性检测Cys / Hcy[32]。亲电NBD衍生物可通过与GSH / Cys / Hcy发生亲核取代反应生成弱荧光的硫醇盐衍生物（例如NBD-S-Cys，NBD-S-Hcy或NBD-S-GSH），然后产生Cys / Hcy可以通过分子内亲核芳香族（SNAr）取代反应进一步取代硫醇盐，从而转化为高度荧光氨基取代NBD衍生物（NBD-NCys / Hcy）[37–41]。由于缺乏近端胺基，GSH不能诱导这种分子内重排反应[42].因此，我们推测将4,6-二甲氧基- 2-嘧啶二硫基醚掺入NBD生色团可能会产生一种新型的生物硫醇荧光探针候选物。从未研究过4,6-二甲氧基-2-嘧啶二硫醚构造荧光探针，它是原始的识别单位。如图所示合成探针1的方案1。探针1可以根据Smiles重排反应从GSH区分Cys / Hcy。探针1对Cys / Hcy的传感机制与报道相似（方案2），并已通过ESI-MS光谱证明。

3.2. 反应的光学性质

在CH3CN / PBS缓冲液（体积比3：7，10 mM，pH 7.4）中进行探针1的光谱评估及其对Cys / Hcy和GSH的响应。图1表示了Cys，Hcy和GSH在10当量的存在下探针1（10mu;M）的吸收和荧光发射响应。加入Cys后，最大吸收带为400 nm的游离探针1减少，并且出现了两个新的以345 nm和478 nm为中心的条带（图1 a)。探针1在CH3CN / PBS缓冲液中不发荧光（Phi;= 0.003），但是，用Cys处理探针1会导致在547 nm处荧光强度急剧增加（荧光增加78倍，图1 b, Phi; = 0.124)。在相同条件下，类似地测量了加入Hcy后探针1的吸收和荧光变化（图1)，与Cys相比，在547 nm处的发射显示出更强的增强，并且荧光强度增加了约113倍（图1b, Phi; = 171)，在GSH的情况下，探针1在400nm处的吸收带红移至419nm，并且没有观察到明显的荧光响应。这些结果表明，在相同条件下，探针1在吸收光谱和发射光谱中对Cys / Hcy和GSH的明显差异可用于检测Cys /Hcy。

图 1在添加100mu;MHcy（红色曲线），Cys（蓝色曲线）和GSH（绿色曲线）之前（黑色曲线）和添加后的探针1（10mu;M）的吸收（a）和荧光（b）光谱分别在25°C下在CH3CN / PBS缓冲液（体积比3：7，10 mM，pH 7.4）中孵育20分钟。

3.3. 探针1对Cys / Hcy的时间依赖性响应

随后，我们对探针1检测Cys和Hcy进行了详细研究。对探针1（10mu;M）进行10当量测试，荧光强度随时间变化如下图所示（图2）。25°C下CH3CN / PBS缓冲液（体积比3：7，10 mM，pH 7.4）中Cys和Hcy的变化，中心在547 nm处的发射带强度在1分钟内立即增加

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