基质辅助激光解吸/电离串联质谱法研究异烟肼衍生N-糖链和他它的生物素化形式外文翻译资料

 2022-09-02 08:09

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文献翻译：

基质辅助激光解吸/电离串联质谱法研究异烟肼衍生N-糖链和他它的生物素化形式

原理：糖链结构表征的成功往往需要在质谱分析前进行衍生反应。在这里，我们报告一个新的衍生试剂--生物素标记的异菸肼，它允许我们通过质谱分析（MS）和生化聚糖对N-糖链进行分析。生物素标记的异菸肼在质谱中的裂解行为和它在结构鉴定中的应用以及和其他实验结果的比较都有在文中说明。

方法：从核糖核酸酶B和卵清蛋白释放中释放糖链，用异烟肼（INH）进行标记，生物素标记的异菸肼（BINH和biotinamidocaproylhydrazide（BACH））。此外，2-氨基苯甲酰胺（2-AB）下面实验备用。比较基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱（MALDI TOF / TOF）实验研究了衍生的裂解模式。最后，生物素标记的异菸肼衍生物结合凝集素的能力进行了探讨。

结果：通常来说，衍生反应能增强质谱检测的信号强度，最重要的揭示结构的离子（跨环裂解）在生物素异烟酰肼衍生产物的光谱中被观测到了，而主要的糖苷裂解以原始形态在糖链和2-氨基苯甲酰胺的衍生中被检测到。

结论：肼衍生法提供了获得结构信息片段离子的方法。由于生物素标记的异菸肼的衍生反应，异构体的特异性片段能够被识别。此衍生化反应不需要进行纯化。生物素异烟酰肼的生物残留可用于生化研究，比如聚糖和蛋白质的相互作用。

聚糖的分析是糖蛋白的很大一部分表征。通常，结合各种色谱—色谱和光谱方法是必需的为了探讨翻译后修饰fi阳离子。它的完整的表征仍然是一个具有挑战性的分析任务。

衍生化有一个悠久的传统在聚糖分析途径。在前时代，化学标记被用来改善糖的波动气相色谱的羟基硅烷化。后来，碳水化合物的特性由其他高性能液体分析方法色谱法（HPLC）、紫外光谱和荧光光谱示蛋白衍生。因此，fluorophoric或有色的标签了在多糖以提高这些敏感性分析物。此外，分析物的疏水性已增加往往导致更好的分离广泛使用的反相的碳水化合物材质。在新分析的发展过程中方法，电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）作为敏感低聚糖结构鉴定方法。尽管当地的糖链的分析可以进行直接衍生应用于增强信号通过提高电离灵敏度。此外，在串联质谱（质谱/质谱）分析，衍生的碳水化合物断裂行为证明是指用标签的类型。

最常用的衍生化方法是还原胺化反应通过希夫基地的形成，主要是伴随着还原步骤，以达到稳定二胺键。广泛使用的标签包括芳基胺试剂如2-氨基苯甲酰胺（2-AB）、2-氨基—吡啶和2-氨基吖啶酮。类似地，肼用醛形成希夫碱产物的试剂对糖的应用。这些衍生产品更稳定的希夫碱产品从胺醛即使没有还原反应。以这种方式，所得连接糖基酰肼，具有几乎本土还原性末端构象。

这证明是非常当使用肼聚糖衍生物的重要生化研究。肼的一种实用优势与芳基胺还原相比，衍生化发现是省略清理的可能性程序。因此，标签可以进行快速，非常容易和最小的样品损失。

不同的肼标签及其变种研究和开发了以钕的最佳标签
聚糖衍生。羧甲基化三甲基肼（吉拉德试剂T）是执行，以便设定一个永久电荷的减少一些中性寡糖，然后结束通过质谱分析。其他阳离子合成了基于吉拉德试剂T酰肼下面的这个目的和应用N-连接聚糖。然而，后来的研究表明，中性标签当与氮耦合时，进行阳离子化试剂—连接聚糖。胍酰肼衍生物检测出的N-连接的糖链，即使在其他生物分析物，如肽的存在。

生物素标记的出现作为一个额外的类标签允许的衍生开发的亲和
糖结合蛋白。这些标签将经常UV活性和生物亲和性。在这对此，聚糖衍生与生物素化的酰肼标签可用于质谱和功能研究，如碳水化合物结合的相互作用研究蛋白质。
在这项研究中，我们已经进行了衍生的氮—与异烟酰肼（INH）及其生物多糖版本（BINH）。糖破碎强度MALDI-TOF MS / MS的研究和比较BACH（biotinamidocaproylhydrazide）和仲丁胺衍生物。我们进一步研究了凝集素结合的属性平阳衍生物。

实验
材料与方法

鸡卵清蛋白（V级），核糖核酸酶B，二羟基—苯甲酸（DHB），2-氨基苯甲酰胺（2-AB），生物蒂娜美度己酰肼，链霉抗生物素涂覆的玻璃幻灯片（质量reg;，柏林，德国），和ConA Alexa氟647是从生活reg;技术购买（达姆施塔特，德国）。异烟肼（INH），DHB和超得到的是由Fluka甘露糖（布克斯，瑞士）。平的合成根据描述的过程在支持信息。glycoclean PNGaseF和trade;从欧罗巴生物制品公司获得了墨盒（剑桥，英国）。去离子水的制备Milli-Q普瑞阳离子设备（微孔reg;，埃施博恩，德国）整个。

从糖蛋白糖链的糖基

用f-protocol：500mu;G糖蛋白是变性水（40mu;1）和反应缓冲液5（10mu;L）去糖基化试剂盒通过加热在100°C 10分钟后冷却，低聚糖被释放的糖蛋白（卵白蛋白、核糖核酸酶B）2mu;LPNGase F酶（孵育时间：18小时，温度37°）。去糖基化蛋白是由200mu;L加入乙醇沉淀，保存在冰~ 1.5 h，离心去沉淀。这个多糖，溶解在上清液，分别在真空干燥和进一步的处理和分析，或衍生下面描述。分析部分~ 5 pmol。

衍生与INH、BINH和BACH
各自的标签4毫克：INH、BINH或BACH稀释在500升50%甲醇（衍生溶液）。聚糖从糖蛋白释放与过量的治疗的衍生化溶液和真空干燥，然后在30°C.，在90°C下，共培养95%升40甲醇1.5 h后，将混合物蒸发干燥溶于100 - 50%甲醇（样品溶液）。

衍生仲丁胺
对2-ab-derivatization溶液由2-氨基50mu;L—苯甲酰胺（5毫克），试剂（7.5毫克），DMSO（500mu;L）和乙酸（200mu;L）被添加到糖释放糖蛋白。后在65°C孵育2.5 h，仲丁胺衍生物与glycocleantrade;墨盒根据制造商提供的协议。糖的衍生物，然后溶解在10微升的水并进行质谱分析。
MALDI-TOF质谱

质谱分析进行使用超前TOF（Bruker Daltonics公司，不来梅，德国）配备电梯设施trade;MS / MS质谱仪。DHB（80毫克/毫升的30%乙腈）和超级DHB（10在50%乙腈中的毫克/毫升）被用作矩阵。0.5mu;LOF矩阵被应用到现场。随后，0.5mu;LOF衍生的N-糖链在MALDI靶点
板。常温下干燥后的空气，MALDI目标被引入到离子源。

光谱是在正离子模式下获得重新fl电子使用柔性控制软件。下列设置为用于毫秒（镜头，50，频率，50，激光功率，50，80%，扫描范围，米/ 200 - 3200）和毫秒/女士（镜头，200；频率，50；激光功率，100 - 150%，扫描范围，米/ z200，3200，窗口范围，16大。质谱/质谱实验进行激光诱导解离。这个质谱获得的记录的原始数据使用柔性分析软件。外部校准采用单独收取的单一同位素峰进行血管紧张素II，P物质和促肾上腺皮质激素18–39片段。用于质谱图的图形glycoworkbench软件版本1.3。

用平阳衍生物凝集素结合分析
阿萍衍生核糖核酸酶B链（从1mg糖蛋白）在50mu;L的样品缓冲液中稀释（20毫米的Tris，pH值7.4，含150 mM NaCl，0.05%吐温20、1%牛血清白蛋白）和0.5mu;L应用到链霉亲和素偶联玻片洗涤之前微孔reg;水。1小时后孵化，幻灯片是用水冲洗2小时封闭液（100 mM Tris-HCl，pH值9，含：150毫米NaCl、0.05%吐温20、0.5%牛血清白蛋白，1%生物素）。随后，玻片与柠檬酸钠缓冲盐水洗（15毫米氯化钠，1.5毫米柠檬酸钠，7）和三倍水。40mu;l凝集素（ConA与Alexa 647标记）被添加到幻灯片，并再次培养1小时的黑暗。然后，在三个步骤中，玻璃幻灯片洗涤PBST（pH 7.4）和Tween 20（含氯化钠137毫米，2.7mmkcl，10mmna2hpo4,2mmkh2po4,0.1吐温20），pH为7.4的PBS（含氯化钠137毫米，2.7毫米氯化钾，10mm na2hpo4,2mmkh2po4）和水。之后，幻灯片是旋转干燥和排放的幻灯片是记录在fl荧光扫描仪在670 nm。相同与甘露糖阿萍和乳糖凝集素结合试验平随后。三种不同浓度（10mu;g，25mu;g和75mu;g）进行了分析。

结果与讨论

N-糖链释放核糖核酸酶B和鸡卵清蛋白标记与INH和阿萍。衍生化反应之间发生还原糖和标签的酰肼（方案1）。衍生的碳水化合物通过MALDI-TOF和MALDI-TOF /分析TOF MS Profi乐谱和断裂行为生物蒂娜美度己酰肼（BACH）、仲丁胺，INH和阿萍衍生工具与衍生的比较对应（图1）。巴赫作为标签衍生的在质谱中的碳水化合物在我们以前的工作调查。在这里，更深入聚糖的MS / MS进行分析。仲丁胺是选择进行比较研究，因为这是现在的一个用于衍生化的寡糖的最常用的标签。

MALDI-MS N-糖链

聚糖酶释放卵清蛋白和核糖核酸酶B衍生的INH、BINH、BACH和仲丁胺和衍生的聚糖池相比。寡糖sodiated分子离子的形成。造成亲fiLES卵清蛋白图所示。2和3。在这种情况下非糖链（图2），22的26个已知的卵白蛋白聚糖可以注册。最高糖属于卵清蛋白m/z一2028.8。其他高聚糖来自平常对卵白蛋白的菌株，为研究由哈维等。可以看出，衍生的卵白蛋白聚糖比本地的信号强度高，特别是高质量的多糖。例如，m/z 2313.9的复合多糖（图2）后观察显明显更高强度的衍生。对于比较，见图3后衍生的光谱（INH：m/z 2432.9；平：m/z 2775.4；巴赫：m/z 2667.4；2—抗体：米/ 2434）。此外，三个额外的糖链结构可检测后衍生化：2复合物和一个混合糖。这些在图3中高亮显示用星号。同时信号的核糖核酸酶B MS光谱强度高甘露糖衍生物相比与本地的（REL。非糖链强度：5 1067、INH和仲丁胺：times;106，她和巴赫：8times;106）。尤其是糖链的甘露糖单位数较高（7，8，9）的亲fi特德从衍生和放弃三倍以上的信号与本地的比较同行（数据未显示）。最强的效果观察异烟肼是信号强度增强和阿萍衍生的9-mannose聚糖。

MS / MS的高甘露聚糖
本机高甘露聚糖的MS / MS谱man6glcnac2（[钠]1419.5）主要表现为乙—与离子和一些跨环的碎片（图4）。这个分裂被分配根据命名多蒙和科斯特洛。高甘露糖的特性糖链的重新收集的离子的存在下形成的从分子离子的甘露糖残基的损失。损失一个（Y4，m/z 1257.4），2（Y3szlig;，m/z 1095.4）、三（Y3alpha;，m / z933.3）或六个甘露糖残基（Y2，m/z 447.1），但不是四fiVE、观察。突出的离子也y涉及失去一个（B4，m/z 1198.5）或两个n—acetylglucosamines（B3，m/z 995.2）从还原端糖。其他离子（内部碎片）所产生的组合B和Y型分裂进行观察（如米/ 1036.3，874.3，712.2，550.2，833.3）。碎片化聚糖显示内部相对高丰度B3 / Y3（d-ion，碎片离子m/z 671.2），造成的损失从B3离子三天线两个甘露糖残基。因此，这方面的fl甘露糖的分布格局指存在的天线之间的残基在6-antenna三甘露糖残基。这种模式碎片是观察哈维一致和劳斯等人。这类多糖。一些交叉环在核心glcnacs分裂进行观察（3A4，3A5）；然而，他们没有诊断意义。MS / MS谱（图5）的INH衍生man6glcnac2聚糖（[钠]米/ 1538.6）表现出相似的糖苷裂解模式作为天然糖。损失一个（Y4，m/z 1376.4），2（Y3szlig;，m/z 1214.5）、三（Y3alpha;，m / z1052.4）和六（Y2，566.3）甘露糖残基，而四和fiVE甘露糖残基缺失在频谱的损失。y的存在（B3，B4）和乙/gamma;的内部片段是相同的频谱的本土对口。然而，对INH信号衍生更丰富。损失3—位于从B3甘露糖为d-ion离子出现在米/ 671.2，这是伴随着水的损失（B3 / Z3szlig;）。这种离子的fiNES的6-antenna组成，由三个甘露糖。跨环裂解0A5在米/ 1318.5（在光谱中的丰度最高）2A5在m/z 1258.4和beta;- 1-4联动的一致壳芯。相对较弱的跨环裂解离子丰度是从核心甘露糖残基（3A3，米/ 583.3；2X2，m/z 1154.4）。离子3A3传达天线分支模式的信息。在这里，它fiRMS的上述解释，三个甘露糖残基组成的天线是一个6个位置。

的阿萍衍生的MALDI-TOF/TOF谱man6glcnac2显示比本地更多的碎片和异烟肼衍生的聚糖（图5）。同时，糖苷和跨环分裂的观察。这里，完全丧失从天线的甘露糖残基可以注册：米/ 1719.1，1556.9，1394.9，1232.8，1070.8，908.7，即四、fiVE甘露糖的损失，相反不与天然糖和INH的观察衍生工具。类似的行为被记录与分析该abdeae（对氨基苯甲酸2 -（二乙氨基）乙酯酯）衍生的高甘露聚糖，那里的碎片离子的光谱包含全系列。一突出了B4离子m/z 1198.5和支离破碎进一步的损失的甘露糖残基（硫），以使离子在米/秒1036.3，874.3，712.2，550.2和388.1。B / y-cleavage参与B3离子m/z 671.2的d-ion和fiNES6-antenna组成的。可以看出，与平衍生的跨环裂解的数量明显增加。最主要的信号的频谱，除了与平标签所涉及的峰（m/z 486.3）是的壳型交叉环（0A5）m / z1318.4。终端的glcnacs进一步分裂相对较弱，但在米/ 1329.5（1A5），1272.4（3A5）

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