稻草快速堆肥中潜在放线菌的分离和筛选外文翻译资料

 2022-12-09 10:12

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稻草快速堆肥中潜在放线菌的分离和筛选

南京信息工程大学环境科学与工程学院应用化学 20131337032 卓玛

摘要：稻草作为水稻种植的副产品生产，主要由木质纤维素材料组成，适用于一般的生物降解。 木质纤维素分解放线菌可用作笨重稻草快速堆肥的潜在药剂。从各种原位和体外稻草堆肥源中分离出二十五种放线杆菌分离物。通过酶降解来选择分离株A2，A4，A7，A9和A24淀粉，纤维素和木质素，然后筛选其对稻草粉改性培养基的适应性。最适合的分离株（A7）被鉴定为碳单孢菌（Micromonospora carbonacea）。 它能够在对照物中显着降解纤维素，半纤维素和碳（P B 0.05）。C / N比在6周的堆肥中从初始值29.3降低到18.1，因此有可能用于稻草的大规模堆肥。

关键词：稻草、 木质素分解酶、 纤维素酶、 微孢子虫、 放线菌生物降解。

1引言

世界上主要的谷物作物米是种植的到14800万公顷以下的生态系统。1960年，稻米总产量达1.5亿吨，2007年达6.45亿吨。至少有114个国家种植水稻，超过50个国家年产10万吨以上（2008年美国农业部）。对于每吨收获的粮食，每年大约有1.35吨的稻草仍然存在，每年产生大量的秸秆（Kadam等人2000）。秸秆的处理是由于大量散装物料，降解速度慢，携带病害等问题。此外，由于其低消化率，低蛋白质，高木质素和二氧化硅含量，它不能用作动物饲料。 在包括马来西亚在内的许多国家，通过露天焚烧处理大量秸秆，造成严重的环境问题以及对公共卫生的威胁。稻草是微生物如细菌，真菌和放线菌的潜在食物来源。它可以转化成一个有价值的终端产品短时间内通过微生物堆肥过程。日本稻谷秸秆堆肥最为普遍适用于提高土壤肥力和提高产量（Hatamoto et al。2008）。为了使稻草堆肥过程在经济上可行，基于木质纤维素分解微生物的生物降解可能是现场燃烧的有效替代方法（Kumar等，2008）。堆肥可以作为有机农业营养的极好来源，以减轻肥料使用量的不利影响，放线菌由于其分解复合分子，特别是木质纤维素成分的能力而众所周知，这使得它们成为堆肥过程中的重要因素（Tang et al。2007）。它们可以在堆肥过程中在高温下生存，并从稻草中产生可溶性碳水化合物（Ball et al. 1990.）。据报道，真菌和细菌在嗜温阶段占主导地位，以利用可溶性和易于代谢的碳水化合物，而放线菌逐渐取代嗜中性种群并占主导地位

在木质纤维素废物堆肥期间，大多数顽固成分矿化成单糖的嗜热阶段（Allgaier et al. 2010）。

因此，预先接种潜在的木质素分解放线菌的稻草的堆肥可能对大米秸秆的有效和快速堆肥起重要作用，因此，研究的目的是分离，选择和表征潜在的放线菌用于稻草的快速生物降解。

2 材料和方法

2.1样品采集的放线菌的分离

从两个主要来源收集样品：原位来源或天然分解的稻草和体外来源或诱导的稻草堆肥。

2.1.1原位来源

从马来西亚马来西亚普特拉大学以及马来西亚瓜拉雪兰莪的水稻种植区收集了天然分解的稻草，稻草残渣和乳制品和山羊养殖场的土壤以及稻田。将5个样品芯从5厘米深度随机取出，并收集在干净的塑料袋中，并在4℃下储存直至使用。

2.1.2体外来源

从用鸡粪修补的稻草堆肥收集体外来源，堆肥过程是在马来西亚普特拉大学堆肥机组进行的，马来西亚瓜拉雪兰莪的水稻农民和智能议程有限公司收集了稻草和鸡粪（536356k），分别吉隆坡，马来西亚。将稻草风干以促进研磨过程，使用研磨机（SJ500）将秸秆粉碎至最大粒度为500lm，秸秆以1：1的比例（w / w）与鸡粪混合，并将水加入到堆肥底物中，充分混合以获得60％的水分含量，使用含水量计测量初始含水量。将堆肥材料置于穿孔聚苯乙烯泡沫塑料容器（50 9 37 9 35 cm）中，并覆盖以保持堆温度和湿度，每隔一天的堆转为第一个3周，此后每周转一次，使用四个重复，每个聚苯乙烯泡沫塑料容器代表一个重复，每天记录温度。 每周收集样品。

2.2木质纤维素分解杆菌的分离

通过将10g样品和90ml无菌蒸馏水放入250ml 锥形瓶中进行分离木质纤维素分解放线菌。将溶液在150rpm下搅拌1小时。通过将1ml样品顺序转移到含有9ml无菌蒸馏水的试管中制备10-2-10-5的系列稀释液。将100mu;l样品移液到放线菌选择性培养基（pH 8.1plusmn;0.2，Difco TM）上，定期检查板。将单一的放线菌集落转移到新鲜的放线菌选择性培养基上，得到纯培养物。

2.3木质纤维素分解活性的生物化学筛选

2.3.1淀粉的酶降解

使用10％淀粉修饰的肌动蛋白选择性培养基（p H 7.9plusmn;0.2）测试放线菌分离物降解淀粉的能力，固定培养基用3mu;l 细菌悬浮液（CFU ml -1）接种，并在28plusmn;2℃下孵育72小时，在培养基上生长的菌落用碘溶液（10％）漂洗，并允许接触30秒，未水解的淀粉与碘反应并变黑，水解淀粉在菌落周围产生晕圈。

2.3.2纤维素的酶降解

在Jensen的培养基上测试纤维素降解（20.0g蔗糖，1.0g K 2 HPO 4，0.1g Fe SO 4，0.5gMg SO 4·7H 2 O，0.5g Na Cl，0.005g Na MoO 4，2.0gCa CO 3，15.0g琼脂，2.0g羧甲基纤维素 和1.0升蒸馏水），其中p H 7.5plusmn;0.2，其中将20mL倒入每个培养皿中（Jensen 2008）。将固体培养基接种3mu;l细菌悬浮液（108CFU ml-1），并在28plusmn;2℃下孵育72小时，然后，用刚果红（1.0mg / ml培养基）的水溶液将培养基喷洒15分钟， 倒入刚果红溶液，并用1M Na Cl吹扫板15分钟，纤维素的降解被视为菌落周围的晕圈，使用菌落周围晕圈的直径来测定纤维素降解的程度（Teather和Wood 1982）。

2.3.3木质素的酶降解

木质素退化使用高射炮（1992）提出的媒介进行了一些修改，培养基含有（g / l）（NH 4）2 HPO 4 1.0，KCl 0.2，Mg SO 4ⅦH2 O 0.2，酵母提取物2.0，葡萄糖2.0，天青B（0.01％w / v）0.1，琼脂15.0和1.0升蒸馏水 p H 7.5plusmn;0.2），培养基含有（g / l）（NH 4）2 HPO 4 1.0，KCl 0.2，Mg SO 4ⅦH2 O 0.2，酵母提取物2.0，葡萄糖2.0，天青B（0.01％w / v）0.1，琼脂15.0和1.0升蒸馏水 p H 7.5plusmn;0.2），将所有试剂溶于蒸馏水中，并在121℃高压灭菌20分钟，并将20mL倒入每个培养皿中。将固体培养基与3升放线菌悬浮液（108CFU ml-1）接种，28plusmn;2℃孵育72小时，木质素降解由培养基上放线菌群的生长指示记录生长直径。

选择的放线菌在稻草粉末（RSP）修饰培养基中的木质纤维素分解活性对基于上述体外筛选具有最佳木素分解活性的五种选择的放线菌（A2，A4，A7，A9和A24）进一步筛选其对RSP修饰的放线杆菌选择性培养基的不同百分比（0,10,20和25％）的适应性，p H的范围为7.5-8.1plusmn;0.2，文化媒体在121℃高压灭菌20分钟，将20毫升的培养基倒入每个培养皿中，将固体培养基用3mu;l的放线菌悬浮液（108CFU ml-1）接种，并在28plusmn;2℃下孵育72小时， 每天记录径向生长。

2.4鉴定潜在（选定）放线菌

使用BIOLOG识别系统（Biolog Inc.，3938，Trust Way，Hayward，CA，USA），使用软件Microstation系统版本4.20来确定放线杆菌的潜在分离物（A7）在木质纤维素分解活性和RSP修饰培养基上的生长 。

2.5潜在分离物（A7）对稻草体外堆肥的评价

选择分离（A7）显示最佳木质纤维素分解活性，最适合于稻草粉改良放线杆菌选择培养基生长，用于体外稻草堆肥研究。将稻草粉碎并通过2mm过滤器过筛， 将稻草和鸡粪以1：1（w / w）的比例混合并用蒸馏水进行混合，得到含水量为60％（w / w）。用水分计（HH2 Meter，DTDelta devices，Cambridge，England）调节含水量，用10％（v / w）浓度为108CFU ml的放线杆菌悬浮液（A7）接种底物（Vargas-Garcia等人，2007）。将经修改的底物转移到各自含有150g底物的塑料袋中并孵育6周， 塑料袋每周定期转动以提供通风，在堆肥过程中3和6周收集样品，未接种的底物作为对照。

2.6 C / N比分析

在每个取样时间内分析了分解稻草的C / N比。 有机物被确定为在500℃下保存4小时的样品点燃重量损失（Storer 1984），总碳计算为有机物Chefetz等人的58％（1996）通过使用消化方法（Brainina等人2004）测量氮含量。

2.7 纤维素，半纤维素和木质素的测定

使用中性洗涤剂（NDF）和酸洗涤剂（ADF）法（Van Soest等人，1991）分析纤维素，半纤维素和木质素含量。

2.8 实验设计与数据分析

所有实验使用完全随机设计（CRD）进行五次重复，数据进行方差分析（ANOVA），并通过PC-SAS软件（SAS Institute Cary NC 2001）使用最小显着差异（LSD）测试显着性。根据其生物化学活性对微生物分离物进行分组，对数据进行聚类分析，并使用S-PLUS构建聚类树（Struyf等，1997）。

3结果与讨论

3.1淀粉，纤维素和木质素的酶降解

从各种原位和体外的稻草堆肥来源中分离出25种放线菌分离物，并评估其在含有淀粉，纤维素和天青B的培养基上的木素分解活性（表1），在碘溶液染色后，二十二株分离株能够在含有淀粉的培养基上产生晕圈（图1a）。由两种聚合物，直链淀粉和支链淀粉组成的淀粉是一种生物多糖，由a-D-葡萄糖组成的mer连接在一起形成大的大分子。显示阳性反应的放线菌可能在淀粉补充培养基上产生葡糖淀粉酶和alpha;-淀粉酶，结果与Nigam和Singh（1994）一致，他们声称放线菌在淀粉水解过程中产生一系列酶，葡糖淀粉酶，alpha;-淀粉酶和葡萄糖异构酶。在刚果红溶液染色后，16种放线菌分离物在含羧甲基纤维素（CMC）的培养基上形成晕区（图1b）。五个分离株（A2，A4，A7，A9和A24）显示出较高的活性，形成较大的区域（gt;5.00mm）），而其他11个分离株形成较小的区域（lt;5.00mm）。分离物A7分别形成最高晕圈（9.00mm），然后分别为A4，A9，A2和A24（8.40,8.20,7.80和6.18mm），CMC-培养基上产生晕圈，确定它们产生负责CMC水解的细胞外内切葡聚糖酶。McCarthy（1987）报道了在含有纤维素的底物上生长期间，几种放线菌产生水解酶，细胞外内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶以及细胞结合的beta;-葡糖苷酶。所有分离株在含有浓度范围为4.02至18.98mm的天蓝B的培养基上生长良好（图1c）。

在25个分离株中，8个分离株（A2，A3，A4，A6，A7，A9，A10和A24）产生了相对较大的菌落（gt;6.50mm）。最高的菌落由分离株A7（18.98mm），然后是A9，A24，A4和A2形成，菌落直径分别为15.96,15.10,10.36和7.66mm。木质素在植物细胞壁中形成不规则的非结晶网络，以保护对生物降解具有高度抗性的纤维素和半纤维素。具有胆汁分解酶系统的微生物可将木质素降解为二氧化碳（Martin Hofrichter，2002）。通过利用木质素分解酶，木质素过氧化物酶和酚氧化酶，放线菌通过扩散化学过程切割木质素屏障（Li et al。2009）。在蓝宝石B培养基上生长的放线杆菌分离物显示出生产木质素过氧化物酶（Li P）的潜力（Archibald 1992; Pangallo等人，2009）。Ramachandran等 （2000）还发现Li P在放线菌中，并且在H2O2存在下观察到增加的活性。Crawford（1978）报道，来自放线菌的木质素腐烂软木被广泛地脱甲基化，变形的芳环并经历了侧链氧化，这被认为产生用于破坏木质素屏障的细胞外木素分解酶和暴露的纤维素和半纤维素用于进一步的生物降解。然而，天竺葵B方法对于LiP酶在放线杆菌中的表达来说不是完全可靠的指标，因为Li P测定是一个复杂的过程。因此，所有选择的放线菌进一步筛选稻草粉（RSP）以确定其木素分解活性。将25株分离株的木质素的生物化学性质合并在一个单一的聚类分析中，产生了一个生物降解的树状图（2011）22：367-375。

表1在含有淀粉、羧甲基纤维素和天蓝B的培养基上测试放线菌对降解淀粉、纤维素和木质素的能力

分离物

分离株

来源

淀粉

*纤维素

晕圈(mm)

*木质素菌落

成长(mm)

正（ ）负（-）

原位

A1

奶牛场

0.00g

5.09h

A2

奶牛场<!--

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