一种荧光超分子化学传感器在细菌培养中随着类固醇衰减外文翻译资料

 2022-12-23 02:12

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一种荧光超分子化学传感器在细菌培养中随着类固醇衰减

摘要：

类固醇已被确定为内分泌干扰剂，这被认为会影响水生生物的生育，甚至可能对人体有直接影响。因此, 去除废水中的类固醇是必不可少的, 这是最有效的微生物处理的实现。我们在此报告的简单荧光的方法来鉴定能够降解类固醇的微生物，并优化类固醇去除的条件。该方法是基于超分子葫芦[8]脲 (CB8), 它可以结合其他荧光染料黄连素或它们腔内的胆固醇。在不存在类固醇的情况下，腔体可以自由地和染料结合，导致荧光的强烈增加。相反，在激素的存在，染料转移到本体溶液。这一原理提供了一个稳定的（无热或光降解）荧光化学传感器（激发约450 nm，最大发射波长为525 nm），它可以检测睾酮浓度gt; 0.7mu;M. 我们发现，这种位移原理可以应用于类固醇睾酮的摩尔浓度的去除从细菌培Buttiauxella

sp.S19-1。该筛选应用化学传感器的可靠性是由一个优秀的Z因子表明，它在0.52 到0.74 的范围内进行了所有的实验。

关键词：荧光 超分子识别 葫芦脲 测定方法 海洋细菌 类固醇

介绍：

高浓度的天然和合成的类固醇和类固醇化合物的全球检测作为人为实施的后果。在水生系统中, 它们充当内分泌干扰的化学物质, 通过引起女性化或男性化、雌雄同体标本和其他与内分泌相关的影响, 影响鱼类种群的繁殖动态。类固醇的人为来源包括人和动物尿和粪便。在废水处理过程中, 通常会对人为来源的类固醇进行处理, 但类固醇的去除往往不完整, 这是由在污水加工厂附近的水生动物的改变证明的。此外, 未经处理的来源是将家畜饲养的粪便直接用作农田肥料或从诸如牛饲养场等相关设施排出。

为了去除废水处理中的类固醇, 微生物处理是至关重要的。迄今已确定了一些特定于不同类固醇的内固醇降解细菌 (有时), 并对其降解所涉及的酶和机制进行了深入研究。现在为止, 环境研究一直集中于雌激素引起的环境效应, 但雄性激素如睾酮及其衍生物被证明也会引起内分泌紊乱, 使睾酮降解的细菌在废水处理中变得越来越重要。例如, 为了分离出在海水中的类固醇降解细菌, 变形细菌Buttiauxella sp.S19-1 被发现代谢睾酮和雌二醇。由于这种细菌适应于高盐浓度的生长, 它的应用在类固醇生物修复的海洋系统已被假设。

各种分析方法已经开发出来, 以检测不同基质中的类固醇, 例如, 牛奶中类固醇检测的荧光极化免疫, 用分子印迹聚合物进行竞争化验, 以及酶/类固醇共轭体用于人体尿中类固醇检测, 或以细胞为基础的生物鉴定检测类固醇受体激动剂用于兴奋剂控制。此外, 在对河流和自来水中的类固醇水平进行环境监测时, 需要在皮摩尔范围内检测限制的高度敏感的方法。然而, 在检测细菌培养的雄激素降解能力方面, 目前使用的是经典的分析方法, 包括薄层色谱 (TLC)、放射性方法、HPLC 法、LCMS 和 GC-MS 以及GC。除了用于色谱分离的分析时间，这些方法通常涉及额外的萃取或衍生化步骤，这使得它们更耗时，从而限制在筛选应用它们的效用。

我们现在报告了一种荧光超分子测定法，可用于在含有类固醇降解细菌的培养物中检查细菌类固醇的消耗。该测定基于荧光染料的大环封装并且睾酮作为模式类固醇的竞争性结合（方案1）。 我们的方法依赖于指示剂置换测定法（方案1a），其在生物化学中已经很好地作为竞争性结合测定法并且已经由超分子化学家改编。其中，超分子受体可以结合染料或分析物。 在没有分析物的情况下，染料的结合通过改变的吸收或荧光发射光谱来指示，而存在的分析物会导致染料流出受体，这是因为恢复光谱信号发出的溶液中不含染料的性质。 恢复的程度直接取决于分析物的浓度。

随后这个概念被延伸到连续跟踪分析物浓度的动态变化，并且所得测定法被称为超分子串联测定法，并且它们已被用于跟踪弱结合底物到强结合产物（反之亦然）。我们最近报道，大环无毒超分子宿主葫芦[8]脲（CB8）作为纳米级结合亲和力的各种类固醇的优良受体。此外，黄连素（BE）是一种已知与CB8形成高度荧光的1：2主客体复合物的染料，因此可通过BE荧光的减少来指示特定类固醇的存在。这已被用于跟踪，例如，猪肝酯酶对诺龙酮-17-丙酸酯进行非诺洛酮的酶促水解。我们因此推断它可能同样适用于更复杂的情况，即遵循细菌中类固醇的消耗。这将提供一个简单的方法来检验不同细菌的类固醇降解能力。 一种简单的基于化学传感器的荧光方法的开发遵循类固醇耗尽，避免繁琐的色谱分离步骤或成本密集型仪器如质谱法，为潜能的应用增添了优势。例如，用于现场或海洋工作的应用程序。

我们展示在这里，作为筛选细菌代谢途径的这种有前景的方法的第一次证明，细菌培养物中睾酮的消耗与Buttiauxella sp. S19-1可以遵循方案1c中概述的方法。细菌Marinobacter adhaerens HP15，其属包括在海洋和盐碱生境中普遍存在的约50种物种被认为是阴性对照，因为彻底的基因组数据库检索表明，Adaderens HP15不太可能降解类固醇（见下面）。

Scheme 1 超分子指示剂置换试验的原理。 b受体，染料和分析物的结构，

c用于监测细菌培养物中类固醇消耗的超分子串联测定法

材料和方法

材料CB8，BE和睾酮来自SigmaAldrich，并且不需经进一步纯化而使用。CB8的浓度通过使用马来酸作为标准的NMR来确定以解释剩余的结晶水。细菌培养物和氨苄青霉素的化学品来自Carl Roth GmbH（Karlsruhe，Germany）并且质量适当。卡那霉素和氯霉素来自Amresco（Solon，OH，USA）。

光谱所有吸收和荧光测量均在（1.0times;0.4）cm石英玻璃比色皿（Hellma Analytics，德国）中进行。为了吸收测量，使用Varian Cary 4000分光光度计并且使用Varian Eclipse分光荧光计进行稳态荧光测量。并使用OriginPro 8.5进行数据分析。

生物信息学日本京都基因和基因组百科全书（KEGG）网站被用于观察 M. adhaerens HP15（途径图 00984 Bsteroid 降解）的类固醇降解能力。另外，将编码参与类固醇降解的蛋白质的基因的核苷酸序列与 M.Adhaerens HP15 的基因组（通过应用一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具（BLAST）搜索用国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行比对）进行比对。相应序列从KEGG中回收，类固醇降解细菌睾丸激素睾酮TK102作为来源。具体的说，是比较3-beta;-羟基类固醇脱氢酶(E.C. 1.1.1.15,KEGG entry O987_11065)，3-氧化甾类1-脱氢酶(E.C. 1.3.99.4, entry O987_07760)，3-酮类固醇-9-alpha;-单加氧酶亚基A(1.14.13.142 entryO987_07520)和类固醇delta;-异构酶(E.C. 5.3.3.1, entryO987_07595)。

细菌培养Buttiauxella sp. S19-1是根据张先生和他的同事（S1N），在 28℃下，在另外含有2.1％NaCl 的 200mL 标准 I 营养肉汤培养基（在 1000-mL 锥形瓶中制备）中，在恒定振荡（250rpm）下培养的。 M.adhaerens HP15 在相同条件下（28℃，以 250rpm 振荡，在 1000mL 烧瓶中200mL 体积）在 Marine Broth（MB）培养基中培养。 通过离心（15 分钟，使用 Eppendorf离心机 5810，德国汉堡的 3000rff）收集指数生长期的细胞（对于 Buttiauxella sp.S19-1 OD600 = 0.5-1.5;对于 Adaderens HP15，OD600 = 0.5-1.0） ）。 为此，将培养物等分并转移至 50mL Falcon试管中。 细胞沉淀用 75％（v / v）过滤灭菌的北海水洗涤两次。之后将细胞重新悬浮并重新组合，并且在不同的测试培养基中将 OD600 调节至 0.5（参见表 1）。含有类固醇的培养物（参见下文 BAssay 方法部分）补充有来自在乙醇中制备的储备溶液（在细菌生长培养基中lt;0.1％v / v）的 100mu;M 睾酮。 乙醇毒性试验排除了任何对细菌生长的抑制作用，Buttiauxella sp.S19-1 和 M.adhaerens HP15，浓度为 0.1％（v / v）。 在含抗生素的培养物中（参见下文的化验方法部分），以 0.858mM 的浓度添加卡那霉素（参见下文的抗生素测试部分）。 细菌培养物在 28℃下以 250rpm 恒定摇动温育。

抗生素测试抗生素治疗是预先测试的，并且在 MB 培养基中进行，对于 Buttiauxella sp. S19-1的情况下的M.adhaerens HP15 和 S1N 培养基。 如上所述，这两种物种都是预培养和收获的。 测试由卡那霉素处理产生的抗微生物作用的布丘氏菌。 S19-1 的范围为 0.043 至 0.858mM，氨苄青霉素的范围为 0.135 至 2.693mM，氯霉素的范围为 0.077 至 1.547mM。 根据支持卡那霉素作为合适候选者的标准（见结果部分），确保了这种抗生素也有效地抑制了 M.adhaerens HP15 的生长。 所有浓度均在 0.5 的细菌 OD 值下进行测试，后者也用于类固醇降解实验。 根据上述参数培养细菌培养物。 作为生长指标的 OD600 值在孵育开始后 1 天和/或 3 天确定。

测定方法对于实际测定，建立了五个不同的条件（参见方案 2）：实际样品（Bbacteria 类固醇）含有补充有睾酮的细菌; 两种阳性对照不含有任何类固醇，并且被包括以通过培养基（仅 Bculture 培养基）或细菌随时间释放的化合物（仅 Bacacteria）发生变化来考虑对报告对系统的最终不利影响; 两个阴性对照含有 ste-roids，但不是（仅 B 样）或死细菌（Bbacteria，类固醇，抗生素）排除任何非代谢类固醇消耗。 从这些培养物中取出 2 mL 等分试样，时间长达 168 h，离心（10 min; 3000 rcf）和无菌过滤（0.2mu;m）除去细菌和其他固体物质，转移等分试样放入石英玻璃试管中，加入 20mu;MBE 和8mu;MCB8。 使用 449nm 的激发波长，用于激发和发射的 5 和 10nm 的狭缝宽度以及 600V 的 PMT 电压来记录荧光。使用 1nm 的数据间隔和平均时间对于每个数据点为 0.1s，在 20s 内提供荧光光谱。

结果

细菌菌株的选择

为了测试我们的测定是否可以可靠地报告细菌的类固醇降解能力，需要两种不同的细菌菌株。 海洋gamma;-变形杆菌 Buttiauxella sp.S19-1 被选为已知的类固醇去分级剂，因为据报道代谢睾酮和雌二醇。M.adhaerens HP15 被认为是不具有类固醇降解能力的菌株，因为迄今尚未报道这种活性。为了证实 M.adhaerens HP15 不太可能降解类固醇，在 KEGG 网站上进行了基因组数据库搜索。事实上，寻找类固醇降解途径中涉及的蛋白质表明这些蛋白质不是在 M. adhaerens HP15 的基因组中编码的，而Comamonas 睾酮的类固醇降解能力很容易被 KEGG 算法证实。 作为一个额外的测试，参与类固醇降解的蛋白质的核苷酸序列与 M. adhaerens HP15 的基因组相匹配，该基因组没有显示任何同源序列。 因此，M.adhaerens HP15 的类固醇降解能力被认为是非常不可能的。

Scheme.2 包括类固醇补充细菌培养物（灰色）以及阳性（蓝色）和阴性（红色）对照的实验设计。 常规样品含有培养基，类固醇，细菌和随后添加的报道对（CB8和染料）。 在阳性对照中，省略了类固醇（仅细菌）或两者，细菌和类固醇（仅培养基）。 在阴性对照中，细菌被省略（仅仅是类固醇）或被抗生素杀死（细菌，类固醇，抗生素）

与不同的细菌生长培养基兼容

不同的细菌生长培养基培养接下来对Buttiauxella sp. S19-1和 M.adhaerens HP15 进行评估。 因此，在不同量的 CB8 存在下 BE 的荧光光谱被记录在不同的测试介质中以确定结合常数和可实现的荧光强度变化（图 1和表 1)。

两种典型的生长培养基通常用于培养所使用的细菌菌株，即 MB 和 S1N 中（见 B 实验设计部分），首先进行了测试。 两种培养基都显示光散射，这导致荧光分析的复杂性，并且加入 CB8 时 BE 的荧光变化不是很明显。 然后我们开始使用无菌北海水和人造海水（表1，介质 1 和 2），它们都让人联想到所使用的两种细菌菌株的天然环境。 在这两种培养基中，超分子报道分子对表现非常好，显示在 104 至105Mminus;1 至 CB8 范围内的结合常数。 为了使细菌生长，加入氯化铵和磷酸钠作为氮和磷酸盐源（培养基 3），而仍需要支持细菌生长的碳源。 我们推断类固醇可以作为唯一的碳源，但谷氨酸（培养基4）和葡萄糖（培养基 5）也被认为是碳的补充来源。 在所有五种培养基中，与 CB8 的结合常数都足够高，因此接下来使用睾酮进行置换滴定。 这给出了大于 105Mminus;1 的 CB8 的结合常数，并且荧光改变了至少 7 倍（Table 1）。 这确保了不仅是 BE，而且在低微摩尔浓度下用超分子报道体系可以可靠地检测到期望的类固醇。 所有培养基中睾

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