金属伴侣，NhpC， 参与腈水合酶的金属中心生物合成外文翻译资料

 2023-03-13 10:03

金属伴侣，NhpC， 参与腈水合酶的金属中心生物合成

原文作者 Yoshiteru Hashimoto

摘要：氯仿假单胞菌B23产生腈水合酶 (NHase)，在工业上用于生产5氰基丙酰胺。尽管nhpC基因（称为P47K) 位于NHase结构基因 (nhpAB）的下游，对于高效表达NHase非常重要，但nhpC的关键作用仍缺乏研究。在这里，我们分别纯化了在nhpC存在和不存在的情况下表达的两种NHase，并对它们进行了表征。用nhpC表达的纯化的NHase被证明是一种含铁的holo-NHase，，-而不使用nhpC表达的纯化的NHase被鉴定为一种载脂蛋白NHase，它是缺铁的。这些发现表明，nhpC在翻译后将铁作为金属伴侣并入NHase活性位点中起关键作用。在NhpC的整个氨基酸序列中，只有N末端与参与钴胺素生物合成的CobW蛋白、脲酶和氢化酶的金属中心生物合成所必需的UreG和HyDB蛋白具有相似性。NhpC含有一个被称为核苷酸结合位点的P-环基序，Lys23和Thr24在NhpC的P-环基序中保守。在每个突变体NhpC(即K23A和T24A）存在的情况下形成的NHase的表达分析导致可免疫检测的突变体NhpC的产生和缺乏酶活性的NHase的显著表达。这些发现表明，含有Lys23和Thr24的完整P-环对NhpC在体内的功能对NHase的翻译后金属中心组装至关重要。

关键词：脱辅酶； 全酶； 铁

介绍

腈(R-CN）是碳原子和氮原子之间有三键的有机化合物。大多数腈类化合物对几乎所有生物都有剧毒，并且很难降解。然而，在自然界中，一些细菌能够将腈直接转化为无毒或毒性较小的化合物。之前的研究表明，腈类化合物的微生物降解存在两种不同的途径（Asano 等人，1982年；Kobayashi等人，1992a;Yamada等人，1979年）。首先，硝化酶催化腈水解成羧酸和氨 (Kobayashi等人，1993年;Komeda等人，1996年）。其次，腈水合酶 (NHase） 催化腈水合成酰胺 (Kobavashi等人，1995） ，然后通过酰胺酶水解成羧酸和氨 （Kobayashi等人，1997）。此外。生成的酸通过酰基辅酶A合成酶代谢成酰基醇（Abe等人，2008年；桥本等人，2005年）。最后，腈被同化为细菌生长的碳氮源（Sakashita等人，2008)。

NHase是金属酶，根据涉及的金属分为Fe型和Co型 (Kobayashi和Shimizu. 1998)。由alpha;-亚基和beta;-亚基组成的Fe型和Co型NHase都经过翻译修饰。Fe-NHases和Co-NHases中的金属离子都位于它们的alpha;-亚基中，它们共享一个特征性的金属结合基序[CXLC (SO2H) SC(SOH)]。包含两个氧化半胱氨酸残基：半胱氨酸亚磺酸 (aCys-SO2H) 和半胱氨酸亚磺酸 (aCys-SOH)。在全alpha;-亚基中，翻译后氧化的Cys-SO2H和Cys-SOH已被去质子化为Cys-SO2-Cys也在holo-NHase中，与beta;-亚基的两个精氨酸（在所有己知的Fe型和Co型NHase中都是保守的）形成盐桥（Hourai等人，2003年;Huang等人，1997年；Miyanaga等人，2001年；Nagashima 等人，1998年）。载脂蛋白酶缺乏金属，相应的半胱氨酸残基很可能未被气化，之前对NHase的研究结果表明了这一点（Miyanaga等人，2004年）。

此前，我们发现了一种新的转译后激活机制，用于红球菌J1的共型NHase，这是一种重要的工业微生物．产生丙烯酰胺和烟酰胺（Kobavashi等人，1992b;Lan等人，2017）。Co与Co型NHase的结合取决于无Co的apo-NHase 和NHase成熟介体（含Co的alpha;-亚基和伴侣蛋白的复合物）之间的a亚基交换(Sun等人，2016;Zhou等人，2008.2009）。我们将这种意想不到的机制命名为自我亚单位交换。

相反，关于Fe型NHase翻译后成熟机制的信息很少。氯仿假单胞菌B23是一种铁型NHase产生菌，它有一个参与腈代谢的基因簇，包合八个基因：mhoR、 OxdA（称为P38K）、amiA、nhpA、nhpB、nhpC（称为 P47K）、nhps（称为 OrfE)和acsA（图1)( Nishiyama et al.. 1991 Sakashita et al.2008)。nhpA和nhpB分别编码NHase的alpha;-亚单位和beta;-亚单位。在培养基中添加甲基丙烯酰胺可显著诱导这些基因，产生的NHase数量占氯仿芽孢杆菌B23总可溶性蛋白质的50%以上。我们发现了整个腈途径'(醛肟）—腈—酰胺—酸的—酰基辅酶A） 包括四种酶，即醛肟脱水酶 (OxdA)、铁型NHase、酰胺酶（AmiA）和酰基辅酶A合成酶 （AcSA)（桥本等人：2005年)。虽然Fe型和Co型phase的结构非常相似，但它们的翻译后激活机制被认为是截然不同的。虽然在基因簇中未发现共型NHase伴侣蛋白的编码基因，但高效NHase表达所需的nhpC位于nnpAB基因的下游。含有质粒pPCN4的大肠杆茵转化子携带NHase基因（NhpAB）和其他三种ORF (OxdA、amiA和nhpC)．产生一种活性重组NHase (Nishiyama等人，1991年)。因为OxdA和amiA分别编码醛肟脱水酶和酰胺酶 (Oinuma等人2003年）它们不参与大肠杆菌中NHase的形成。尽管己经发现nhpC对NHase的功能表达很重要，但在含有质粒pPCN7的大肠杆茵转化子中未检测到NHase活性，该质粒携带oxdA、amiA和nhpAB，但不携带nhpc (Nishivama等人11991）。然而，NHase的产生量非常低．只能通过免疫学方法检测到。因此，nhpC在活性NHase形成中的作用仍知之甚少。在这里，我们的研究表明，NhpC作为金属伴侣参与了铁与NHase的结合。

材料和方法

重组Nhases的表达。以pPCN4为模板，通过PCR扩增nhpABC基因。使用了以下两个寡核苷酸引物：一个正义引物 (nhpA-S). 5-GAATTGTAGGAGGAATGCATATAGTATCATTCATTCACCG-3包含Ndel识别位点（下划线），和一个反义引物 (nhpC-AS)，5-GGATCCTCAGTCGGTTGAACGCCATG-3，包含一个BamHl识别位点（下划线）。将扩增的DNA亚克隆到载体pHSG398中，并进行DNA测序。插入的DNA用Ndel和BamHl消化，然后插入pET-24a（ ）的相应位点。所得质粒命名为pET-nhpABC；在这个结构中，nhpABC基因受T7启动子控制。至于仅含有nhpAB基因的pET nhpAB的构建，使用含有BamHI识别位点（下划线）的反义引物5-GGATCCTCATGCGCTCTCTCGCTGGG-3-代替nhpC作为PCR的反义引物。

用pETnhpABC或pET nhpAB转化大肠杆菌BL21 (DE3)。并用重组细胞生产和纯化重组NHase。转化细胞在37°C条件下，在含有50ug/ml卡那霉素的10mL 2times;YT培养基中相互摇动培养。过夜培养后，将整个培养物接种到0.5升含 有50 mg/l FeSO4.7H20 和50ug/ml卡那霉素的2xYT培养基中，然后在37°C下摇动培养15小时。然后将IPTG添加到最终浓度0.1mM以诱导T7启动子，并在15°C下进一步培养24小时。

重组NHase（nhpABC）的纯化。所有纯化步骤均在0-4°C下进行。在整个纯化过程中使用含22mM正丁酸和20%甘油的HEPEST4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙基磺酸]-KOH (pH 7.2)。以16200xg离心20分钟

步骤1：制备无细胞提取物。将从0.5l培养液中清洗的细胞悬浮在含有22mM正丁酸和20%甘油的100ImM HEPESKOH (DH 7.2）中，然后用201 M型内窥镜（东京久保田）在200 W下超声破碎20min。通过离心去除细胞碎片。

步骤2：硫酸铵分馏。用硫酸铵（30-60%饱和）分离所得上清液，然后用含有22mM正丁酸和20%甘油的10 mM HEPES-KOH (pH 7.2）透析。

步骤3：DEAE-Sephacel柱层析。将透析溶液应用于DEAE Sephacel柱 (200 ml; GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州，美国）上，该柱与含有22mM正丁酸和20%甘油的10 mM HEPES-KOH (pH 7.2) 平衡。在同一缓冲液中，通过将KCI从0线性增加到0.6 M来洗脱蛋白质。收集活性组分。然后添加硫酸铵，使饱和度达到65%。通过离心收集沉淀物。将其溶解在含有22mM正丁酸和20%甘油的100mMHEPES-KOH (pH 7.2） 中，然后用含有22mM正丁酸和20%甘油的10 mM HEPES-KOH (DH 7.2)透析

4.资源Q柱层析。将透析溶液应用于Resource Q柱 (6 ml; GE Healthcare)，该柱与含有22mM正丁酸和20%甘油的10mM HEPES-KOH (pH 7.2） 平衡。在同一缓冲液中，通过线性增加KCI从0增加到0.5 M来洗脱蛋白质。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)证实纯化蛋白的均一性。

重组NHase （nhpAB）的纯化。为了纯化NHase（nhpAB），改变了以下步骤。SDS-PAGE后，收集含有25kDa条带的组分。至于硫酸铵分馏，无细胞提取物用硫酸铵（10-30%饱和）分馏、酶分析。除非另有说明，否则所有反应都是在线性条件下进行的，且含有适量的蛋白质和适当的反应时间。标准分析混合物由30mM磷酸钾缓冲液(KPB)(pH 7.2)、100 mM丙腈和适量酶组成，总体积为500ul。通过添加酶开始反应，并在10°C下进行5min。通过向反应混合物中添加250ul甲醇停止反应，离心得到上清液（23300xg. 10min)。通过气相色谱法测定反应混合物中形成的丙酰胺量，使用岛津GC-9A系统（日本京都)，配备火焰离子化检测器，使用2.1-mx3.2-mm (ID）玻璃柱，填充Propak类型PS (80/100日； Waters. Inc. Miford . MA. USA)。进样器和色谱柱的温度分别为250°C和190°C。NHase活性的一个单位被定义为在上述条件下催化生成1umol丙酸酷胺/分钟的酶的量。使用Nacalai Tesque 蛋白质分析试剂盒 (Nacalai Tesque Iinc,京都)以生血清白蛋白为标准，通过Bradford (1976）的方法测定 蛋白质浓度。

分子质量测定。将纯化的酶样品应用于Superose G HR10/30柱(GE Healthcare)。该柱连接至AKTA净化器 (GE Heaithcare)。然后用含有22 mM正丁酸、20%甘油和0.15 M KCI的10mM HEPES-KOH (pH72）洗脱。在280 nm处记录流出物的吸光度。根据标准蛋白质的流动性计算酶的分子量，即谷氨酸脱氢酶（290 kDa）、乳酸脱气酶 (142 kDa)、 烯醇化酶 (67 kDa)、腺苷酸激酶(32 kDa)和细胞色素c (12.4 kDa)。

金属分析。所有玻璃器皿在1M HCI中浸泡一夜，然后在使用前用蒸馏水彻底冲洗。在分析之前，用1mM KPB (pH 7.0）透析酶。使用感应耦合氩等离子体分光光度计1CAP-575（日本雅留乐灰烬有限公司.京都）分析含有2mg/ml的酶样品。

圆二色谱（CD)分析。CD测量使用Jasco光谐仪了-720W/型（日本光谱仪公司，东京)进行，该光谱仪配备了20°C温度下的热培养系统和0.1-cm光路电池。在远紫外区域 (200-260 nm），用蛋白质浓度为0.2mg/ml、pH值为7.0、10mM KPB的0.1cm光路细胞对纯化酶和每个突变体进行CD测量。CD光谱中的椭圆度被标准化为蛋白质浓度。

电泳。根据Laemmli (1970）的规定，SDS-PAGE在12%聚丙烯酰胺平板凝胶中进行。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。酶亚基的相对分子质量由标记蛋白的相对迁移率确定，即磷酸化酶b (97 kDa)、牛血清白蛋白(66 kDa）、卵清蛋白 (45 kDa)、碳酸酐酶（30 kDa）、大豆胰蛋白酶抑制剂 (20.1kDa）和a-乳清蛋白 (14.4 kDa)。

pET-NhpABC-H的构建。以pETnhpABC 为模板，通过PCR扩增缺少终止密码子的nhoc基因。使用了以下两个寡核苷酸引物：一个正义引物 (nhpc-S). 5-Catatgattgaaggcgccaggc-3，包含Ndel识别位点（下划线）：以及一个反义引物(nhpC-His-AS) . 5-GTCGACAGTGTGTGAACCATGG-3. 包含一个Sall识别位点（下划线）。将扩增的DNA亚克隆到载体pHSG398中，并进行DNA测序。将插入的DNA用Aatll（其切割位于nhpC基因内的独特限制性位点）和Sall消化，然后插入pET nhpABC的Aatl和Xhol位点。所得质粒命名为pET-nhpABC-H，在这个结构中，nhpC被表达为C-末端组氨酸标记的nhpC。

定点突变。通过重叠延伸PCR方案（Ho等人，1989年;Pogulis等人，1996年）在nhpC上进行定点突变。为了构建K23A突变体，以质粒 pETnhpABC 为模板，用引物对nhpc ( K23A)-S (5cctcggcgcggcgcaaccccccctoctc-3）加T7T和A1 (5-tctgcagctoctactoc-3)加nhpc (K23A) -as (5

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