基于聚乙二醇的超分子水凝胶胶囊外文翻译资料

 2022-09-14 07:09

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基于聚乙二醇的超分子水凝胶胶囊：

可降解生物材料设计的合理方法

摘要：基于聚乙二醇的超分子水凝胶胶囊是一种很有前途的具有特定性质的软颗粒材料。有人提出了一种通过液滴微流控进行精确控制以生产这种粒子的方法。线性聚乙二醇前驱体聚合物在两边链末端携带有联吡啶基团通过二价铁离子的络合被凝胶化。把活体哺乳动物的细胞封装入胶囊内，以便于研究微凝胶的生物相容性。微凝胶的弹性是通过PEG前驱体在不同浓度下的分子质量和对细胞存活率的影响来控制的，其中超过90%的研究可以进行优化。在温和的条件下，可逆超分子聚合物可以被降解，而不会影响封装细胞和释放细胞的存活率。

关键词：封装细胞；液滴微流控；凝胶；金属络合；超分子结构

1、引言

超分子水凝胶是由水溶胀聚合物网络通过物理相互作用交联组成的，如通过氢键交联，过渡金属络合，疏水缔合，离子吸收及pi;-pi;堆积。这些相互作用的可逆性使得超分子水凝胶可以通过外部刺激被降解，此功能可以使这些材料在生物医学领域，包括药物输送和组织工程领域得到应用。在这些应用中，保证凝胶具有良好的细胞相容性和使用尺寸在10mu;m内是十分有必要的。

微凝胶颗粒的制备可以通过液滴微流控的精确控制来执行。在这种方法中，单分散乳液液滴被当做样板用于微凝胶的合成。为了实现这个目的，水性聚合物溶液流体（分散质）在一个微通道中形成，然后被不混溶的油流（连续相）间歇性地破坏。所得到的液滴的大小是由流体流速，微通道的尺寸和界面张力所决定的。由于所有的这些参数是恒定的和可控的，所以液滴的大小是单分散的并且可以根据选择试验参数来决定。随后液滴凝固保留有均匀性，并产生单分散粒子系统。如果这可以通过可逆的化学反应或物理反应的相互作用来实现，那么相应的微粒可以根据需求来设计，可以引起添加剂的可逆封装，包括细胞。

有了这种微流控的方法，Abell和他的同事们制备了超分子胶囊，这是由交联聚合物纳米复合材料和葫芦脲配合物组成的。由于超分子的交联，这些胶囊可以被一电子还原的甲基紫精所降解。然而，在这种方法中，稳定的微胶囊的形成需要微滴前驱体脱水，这是诸如蛋白质和细胞这种敏感的生物活性化合物封装所具有的一个缺点。在现有的另一个研究中，杨和他的同事们用微流控芯片来制备通过氢键交联有机小分子而形成的微凝胶。但是这种方法要求在70摄氏度时达到乳化。这种方法要在高温下进行又不利于敏感化合物的封装，为了寻找替代方案，几个小组分别基于藻酸盐、琼脂糖和明胶天然高分子的可逆交联发现可降解微粒，所有的可以用于细胞封装。然而，天然聚合物是有缺点的：首先，它们的组成会发生变化，因为它们的成分通常是来自于几个不同的生物体而不是一个单一的个体；第二，不是所有的天然聚合物都可以大批量生产的，因为在生命有机体中的支架在衍生时受到尺寸的限制；第三，在应用中，为了完成具体要求，改性和剪裁天然高分子材料的能力被限制，因为它们的组成是由有机生物体决定的，为了克服这些局限性，合成聚合物已被用于细胞负载微凝胶胶囊。但这些方法大多依赖于永久性而不是可逆的聚合物交联。部分特列已由Fraser等人提出，他表明以联吡啶为中心和二甲基丙烯酸酯改性的PEG通过铁络合形成水凝胶，这是通过对丙烯酸甲酯基团共价交联来完成的。这种方法可以形成凝胶的超分子和共价键交叉链接，可以由可逆金属配合来刺激响应。然而，鉴于金属配合物的降解降低了这些凝胶中的链连接度，并没有使之完全侵蚀，从而阻止了它们在可逆细胞中的应用。因此，缺乏持续的细胞负载的微凝胶颗粒可以结合高分子合成，可调控与可逆交联性优势。这种凝胶会提供一种新的刺激响应材料，这可以精确地应用于生物医学和生物细胞物理学领域，就像Kumacheva和他的同事们提出的一样。

在这方面的贡献中，我们利用超分子交联液滴微流控来制备基于合成聚乙二醇（PEG）的可降解凝胶，如图1 所示。我们用在两边链末端携带联吡啶（bpy）基团的线性PEG前作为驱体聚合物，结构表示为bpy-PEG-bpy。这部分可以使二价铁离子转化为三价，使得高分子聚合物链接并形成一个纯粹的超分子交联，可以完全可降解的聚合物网络结构。为了研究微凝胶的生物适应性及其潜在的生物应用，我们将两种不同类型的哺乳动物细胞封装形成胶囊，使用淋巴母细胞作为悬浮细胞的模型，用小鼠乳腺癌细胞作为贴壁细胞的模型。使用在不同分子量、不同浓度下的bpy-PEG-bpy前驱体来研究微凝胶弹性对细胞存活率的影响。在所有情况下，细胞存活率都表现优异，封装的细胞可以在体外触发而重新释放，超分子链交联的恢复可以不损害细胞存活率。

2、结果与讨论

我们使用市场上销售的预聚合的PEG合成bpy-PEG-bpy而不是用环氧乙烷聚合单体。这种方法很具有吸引力因为它只涉及到简单的合成步骤，这也为凝胶形确保了良好的一致性和可重复性，因为PEG前驱体可以通过供应商得到。首先，我们将PEG转化为聚乙二醇二胺。并通过钯催化的吡啶N-芳基化反应来合成羧酸官能化的alpha;，alpha;rsquo;-双吡啶。其次进行联吡啶N-氧化物的还原和酯的水解。通过酰胺偶联合成的联吡啶羧基可以被接枝到聚乙二醇二胺上，方案1中对合成路线进行了总结。

我们使用通过软光刻法制得的聚二甲基硅氧烷（等离子体解析质谱法）微通道，用于bpy-PEG-bpy前驱体聚合物制备细胞负载超分子微凝胶的模板，这些通道是由一批两个顺序联结点和一个微注射单元组成的，如图1所示。这种联结点用于产生微凝胶液滴。而微注射单元可以使皮升级别单位的试剂注射入液滴中，使其凝胶化凝固。我们使用微流控装置，并向其中注入一份在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的bpy-PEG-bpy浓溶液以及一份单独的细胞悬浮液。这两种液体在微通道的第一个连接处相遇，在这里它们形成层流，如图1A所示。在第二个连接处，不混溶石蜡油的流动引起层流周期性的破裂，经检验在培养的数小时内细胞是无毒的（发现细胞存活率在培养前后无差别）。通过这种方式，得到单分散的微凝胶液滴，如图1B所示。在下游3mm处，大约400pl的硫酸亚铁水溶液注射入每滴液滴中，如图1C所示。这是由电场（大约8MV m-1）中空间约束失稳的液滴界面造成的。因此，由于联吡啶官能化聚合物链末端二价铁离子的络合，液滴直接发生凝胶并形成聚合物网络结构，见图1 （插图示意图）。为了得到均匀的颗粒，我们让它们在微注射下游流经一个曲折的通道。这种方法促进颗粒内的注入相的混合，然而，由于前驱体流体的高粘度和快速的凝胶化，得到了咖啡豆状颗粒而不是球形颗粒，如图1D所示。然而，这些颗粒表现出紧密的分散体积，可以从二维俯视图光学图像中颗粒的面积分析得出，如图1D所示，表示平均每粒（27,500 2300）mu;m2。在微通道实验结束后，微凝胶从油相转移到细胞培养基中，这可以通过对微凝胶的离心来实现（1000 RCF，5min），用移液管移取上清液有机相，让微凝胶在细胞中再悬浮，重复此程序三遍。在细胞中，根据微凝胶的组成及其颗粒膨胀在190~280mu;m范围内，伴随有微凝胶形状的均匀化。封装细胞在凝胶内均匀分布，我们没有观察到有任何颗粒凝聚的现象。

使用合成PEG前驱体聚合物来合成凝胶的特殊优点是在于聚合物的物理性质可以被控制，凝胶的性质可以进行调整。例如，PEG前驱体分子质量的变化可以改变凝胶的弹性。我们利用这种方法优化微凝胶弹性并封装了K-562和M6C细胞。我们使用两种不同的bpy-PEG-bpy前驱体，一种Mn=1.5KDa，另一种Mn=6.0KDa。此外，我们使用不同浓度的bpy-PEG-bpy，如表1所述。对于所有的这些样品来说，硫酸亚铁与PEG的比例是一定的，分别是1:3。通常PEG相、细胞相、硫酸亚铁相的体积流量与连续油相的流动速率比是10:10:10:200mu;Lh-1。因此，在微凝胶颗粒中bpy-PEG-bpy的浓度是其在前驱体溶液中的三分之一，如表1所述。将微凝胶在22摄氏度下培育1小时，通过荧光细胞活性检测可以估算封装细胞的存活率。在这段时间内，细胞可以长出新的细胞外基质，并可能在不利的限制情况下表现出凋亡。我们在每批至少有30细胞负载微凝胶颗粒的基础上估算细胞存活率，一共至少有150个细胞。由于每个微凝胶颗粒是一个独立的个体，每个细胞负载微凝胶颗粒是一个独立的凝胶样品。这种情况保证了统计结果的相关性，每个颗粒所含细胞数大约是15 5.。没有证据表明对细胞存活率的统计差异不在此范围内。

这两种类型细胞的存活率随着基质凝胶组合物质变化而不同（表1），超过90%的细胞在PEG6.0-KDa处保留有最大存活率，如图2所示。对两种类型的凝胶bpy-PEG-bpy细胞进行1小时的培育，所表现出来的细胞存活率是（85 9）%。不同样品的微凝胶在类似所有的情况下的凝胶速度都非常快。因此，我们认为凝胶硬度是导致在不同样品中有不同细胞存活率的主要原因。为把细胞存活率和微凝胶的弹性联系起来，我们对具有相同微凝胶组成的宏观凝胶样品进行振荡剪切流变，这种方法作为微凝胶弹性的定性测量。据估计，GOrsquo;（PEG6.0-KDa，133gL-1）的与频率无关的平稳弹性模量为4.8KPa，GOrsquo;（PEG6.0-KDa，267gL-1）=15.5KPa，见图S2.这些估算表明低浓度的PEG6.0-KDa凝胶比高浓度的PEG6.0-KDa凝胶软。相比之下，PEG1.5-KDa的基质比GOrsquo;（PEG1.5-KDa，133gL-1）=0.7KPa的PEG6.0-KDa基质软。这一发现可以解决在凝胶中由于PEG短链段出现的可能性更大而引起的交联低效问题，从而可以协调两边末端的二价铁离子。

M6C贴壁细胞的存活率在不同的PEG6.0-KDa基质中无明显变化。这一发现表明，这些细胞可接枝的弹性范围很大。相比之下，K-562淋巴悬浮细胞在低浓度的PEG6.0-KDa基质中表现出来的存活率要高于在高浓度下相同的基质，在更柔软的凝胶中，特别是PEG1.5-KDa凝胶中，K562细胞的存活率要比在相同浓度的PEG6.0-KDa基质中要低。这种效果可以用来阻止凝胶中的营养物质和代谢产物的微观流动扩散，降低贴壁和悬浮细胞的存活率，尽管这些凝胶基质的宏观刚度更低。

能够使二价铁离子交联的配位体可以导致细胞负载微凝胶的降解。我们通常使用的是乙二胺四乙酸二钠水合物（EDTA-NA2），这会和二价铁形成强配合物（logK1=14.3）。为了得到微凝胶降解动力学的定量估计，我们把微凝胶颗粒注射入另一个PDMS微流控装置中，其中，它们粘在PDMS表面，并可以用在PBS中含有0.1M EDTA-Na的溶液中漂洗，如在图3A所示。作为比较，第二批微凝胶在相同设备中用纯PBS漂洗。微凝胶的降解可以用光学显微镜来观察。在EDTA-Na2溶液中，完整的微凝胶降解在1小时内完成，而PBS颗粒的侵蚀超过了3小时，如图3B-G所示。为了证明引发的降解不会影响细胞存活率，我们从PEG1.5-KDa微凝胶中释放出M6C细胞，这些细胞表现出81%的存活率。为此，把微凝胶放在22摄氏度下的0.05M EDTA-Na4溶液中培养。1.5小时后，把这些细胞经离心后回收，并重新测量存活率。我们发现剩余细胞的存活率仍为81%，可逆微凝胶交联保证了良好的生物相容性。

3、结论

通过控制微流控粒子模板，我们设计了由合成大分子前驱体制备出可逆交联的微凝胶颗粒，其潜在的生物适用性已经通过超过90%存活率的封装哺乳动物细胞表现出来。在温和条件下，微凝胶中加入竞争性配体使其在1.5小时内降解，此时封装细胞和释放细胞的存活率没有影响。由于微凝胶的降解是由于外部刺激引发的，不会出现内部作用的结果，例如：酶胶裂解。对于在人工细胞外基质内保存、研究、操作的细胞来说，这种方法将是迈向新平台的重要一步。而随后的细胞收集和进一步的研究会为触发细胞释放建立起一套更加标准可行的方法。此外，可降解微粒可以成为制造更大组织结构的基本组成。到目前为止，由这种方法得到的微凝胶并不适合长期使用，因为它们会在几小时内自动降解，克服这种局限性的方法是采用增加可逆缔合基团的密度，使其链缠结程度增大。这就需要高分子侧基官能团化而不是要端基的官能团化。这一挑战将会成为我们小组目前研究的重点。

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