软体动物壳形成：理解生物矿化新概念的来源外文翻译资料

 2022-01-12 09:01

软体动物壳形成：理解生物矿化新概念的来源

摘要：生物形成晶体的方法是令人惊讶的。软体动物通过使用疏水性丝素凝胶来形成它们的贝壳。这种疏水性丝素凝胶是一种富含酸的蛋白质，也是形成晶体一个重要的含量前体相。 贝壳形成的过程发生在高度结构化的壳质框架中。 在这里，我们提出了一个问题，这些不同的组成是如何协同作用生产出软体动物壳高度结构化的珍珠质层的。

关键词：生物矿化·晶体生长·凝胶·软体动物壳·珍珠质层

介绍

在过饱和的溶液中形成的晶体很少，即使是有，也只是一个仅受溶解度因素支配的直接的自发的过程。生物晶体是在充满水的环境中形成的，因此几年前人们就认为生物晶体是在过饱和溶液中形成的。在一些生物矿化工过程中，这理论系统已经发展出了难以置信的控制方法，但得到的结果是，即使是像过饱和溶液的存在这样最简单的概念，都不正确。新的研究发现让我们对生物矿化机理的认识发生了根本性的变化，其中很多认识的变化是在研究时软体动物壳的形成时发生的。本文将描述研究软体动物壳形成的结果和提出一些可能影响其他生物矿化过程的新概念。

与许多其他矿化生物（包括脊椎动物）一样，软体动物首先将其矿物形成环境与外界隔离开来 [1,2]。软体动物形成壳的器官存在有高度交联的蛋白质层（角质层）和地幔的上皮细胞，在这个器官的空间内可以制造出一个包含各种大分子的基质。该基质就是矿物形成的框架。这种基质的主要成分是多糖beta;—几丁质以及亲水蛋白的复杂组合，多糖beta;—几丁质是一种相对疏水的丝蛋白，亲水蛋白的复杂组合很多都富含天冬氨酸[3]。制造过程的最后阶段是在基质中形成矿物本身，而一些酸性蛋白质在形成时也在矿物相内被吸留。成熟软体动物壳中的矿物质通常是文石，有时是方解石，在某些分类群中，相同的壳可能有层状方解石和文石层（参见参考文献[1,3,4]）。

（图1）

图1.来自双壳A. rigida（A，C）和头足类鹦鹉螺壳（B，D）的珍珠层的扫描电子显微镜（SEM）图像。珍珠母是许多软体动物物种沉积的矿化组织类型，用于构建其贝壳的内层。双壳类和头足类是两种主要的软体动物类。两者都有蓝图基本相同的珍珠层。牛角蛤珍珠层的断裂部分垂直于壳体。成熟珍珠层由薄（约30 nm）的基质层组成，基质层与较厚层（约500 nm）的碳酸钙矿物文石（薄片）平行铺设于内层的壳表面以及地幔中的贝壳构造细胞层。基质层很薄，以至于在截面中无法检测到（箭头表示层间基质的位置）。由不同软体动物类别形成的珍珠层的超结构之间的显著的差异在于晶体持续存在垂直于壳表面的方向：在双壳类中，并置层的文石片几乎不对齐，而在头足类动物中它们在垂直方向上形成约50个对齐的片层堆叠。 B）用EDTA轻微蚀刻，固定在临界点干燥后，鹦鹉螺珍珠层的断裂部分。在蚀刻和随后的临界点干燥期间，片层膨胀。因而在蚀刻的矿物片层（箭头）之间可清晰见到60-70nm的层。 C）内壳表面（A. rigida）上的珍珠质生长前沿的SEM图像。单独的文石片在下面的基质片上成核（在该制剂中不可见）并在垂直于壳表面的方向（结晶学c轴）上快速生长。在片层达到其最大厚度后，平行于薄层生长。不断增长的晶片是六边形的。文石片生长并在连续层中合并在一起时，仅呈现为不规则的多边形形状。该图像显示了叠加生长层的三个特征明确的梯田。箭头表示增长方向。据推测，套细胞与生物体中的阶地并置。 D）EDTA蚀刻和临界点干燥的文石片显示出胶体颗粒（50-100nm，箭头）的纹理，这是从无定形前体生长出来的晶体的典型特征

珍珠层包含均匀厚厚的由有基质层隔开的文石晶体层（图1）。这种非常简单的几何结构极大地方便了对其结构的研究。1984年，Weiner和Traub [5]提出了珍珠层中层间基质结构的模型。该模型主要基于透射电子显微镜（TEM）观察形成珍珠层[6]和成熟珍珠层的X射线和电子衍射研究[7,8]。这个模型的机制含义表明几丁质被埋在丝素蛋白层中，因此它是一个被动实体。丝素蛋白是一些酸性蛋白质的底物，它负责文石晶体的外延成核。外延的证据基于观察到的文石a轴与几丁质原纤维的对齐 [5]。该模型的一个缺点是没有直接的证据表明丝素蛋白本身是结构化的，也不能说明其与几丁质对齐的。这是因为在该模型中，晶体和几丁质之间有一个中间层，衍射图案表明几丁质和晶体本身是在分子尺度上排列的。观察到的相对弱的beta;-片结构很可能来自酸性蛋白质。

Levi-Kalisman等 [9]为避免干燥伪影的引入，使用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）重新审视了这个问题，。 他们发现，层间基质几乎全部由beta;-几丁质组成，很少或没有丝状蛋白质的存在。 当Weiss等人表明在软体动物幼虫中，通过无定形碳酸钙前体相的初始沉积发生文石壳的矿化，这问题有增加了另一个复杂程度。 Nassif等人[11]最近证明，成熟软体动物贝壳珍珠质的珠光片由无定形碳酸钙的薄表面层包覆着。成熟棘皮动物使用瞬时阶段策略形成它们的钙化骨架的报告[12]表明成熟软体动物很有可能是通过瞬时非晶相形成它们的壳，但到目前为止并没证实。

讨论

本文提出了新的可以作为一个待测试和改进的工作模型的珍珠质结构合成方法。首先，回顾一下对矩阵主要结构元素的了解。

几丁质：几丁质具有平行链的beta;-形式，而不是具有更常见的反平行链alpha;-形式[13]。它是高度有序的，并且在几微米的长度尺度上具有择优取向，这点在X射线和电子衍射图[7,8]以及从冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）获得的晶格图像中可以证明[9]，只有在特殊情况下，择优取向才会延长间距。 几丁质纤维有序地排列在珍珠层中的单个晶体片下。

丝素：丝素通常是珍珠质中主要的蛋白质部分，它富含甘氨酸和丙氨酸，或仅含甘氨酸[14]。当成熟壳的矿物质溶于EDTA时，大多数的丝素是不溶的[15]。冷冻透射电子显微镜对EDTA-脱矿质珍珠层结构的研究并不能揭示丝素的可识别结构。 此外，几丁质和丝素的体外组装不能提供与纯几丁质有任何不同的图像或衍射图案，这也再次暗示丝素部分不是有序的[9,16]。珍珠质基质富含甘氨酸和丙氨酸的蛋白质的序列显示，珍珠质丝素与节肢动物丝素相似，其中与蜘蛛丝的丝素最为相似[17]。需要注意的是，丝腺中的蜘蛛丝是高度浓缩和水合的，而不是有序的[18]。蜘蛛丝在从丝腺挤出过程中变成纤维状并且有序排列[19]。重组丝形成无序和缠结肽链的水凝胶[20]。

Pereira等人[21]报道，含有丝素成分约0.05％wt的蛋白质矿物质会从珍珠层中渗出并变成粉末，悬浮在水中。丝素部分在体外抑制碳酸钙结[22]，类似于重组的丝虫丝蛋白的抑制作用[23]。最近，我们通过在潮湿条件下使用环境扫描电子显微镜观察了从双壳类动物的珍珠层中渗出的蛋白质物质（图2）。在高度水合条件下，该物质具有凝胶状特性，但在远低于水的露点的压力下，水保持在凝胶内（图2A和B）。当水在更剧烈的条件下蒸发时，该物质干燥成为薄膜（图2C）。凝胶状材料对漂白剂和蛋白酶的处理敏感（图2D），因此，我们充相信这种凝胶状材料由Pereira等人分离的丝蛋白组成[21]。我们还注意到，表面蚀刻矿物相后层间的基质层的厚度约为未蚀刻层的两倍（图1），这表明当矿物被去除时，基质的体积会膨胀。总之，该信息与在形成矿物质之前处于水凝胶状态的丝素一致。我们推测，当矿物形成时，一些水从丝素凝胶中除去。在成熟的珍珠层中，丝素仍然能在相邻的多边形晶体之间或晶体和几丁质基质之间划分出来。

（图2）

图2.垂直于A. rigida珍珠层的断裂表面的湿模式环境SEM（ESEM）图像。将样品置于水下并在低于水的露点的6托的蒸气压下缓慢干燥，然后在58℃的水的露点下观察。在安装和第一图像（A）之间经过大约2小时。在此期间，丝状蛋白质从矿物层之间渗出，并且可看到是稀释的凝胶物质，其逐渐凝结成薄膜。 A）样品仍然是大部分被水覆盖，但仍然可以检测到层状结构和文石片。在电子束下干燥选定区域（顶部中心），出现非常水合的珍珠层片材料。 B）随着进一步干燥（与A中所示的区域不同），珍珠片看起来覆盖有逐渐冷凝的水合凝胶状有机材料（箭头）。 C）将压力降低至远低于水的露点长时间后完全干燥的样品。将凝胶状物质干燥成片覆盖片层边缘。 D）使用与A）C）中相同的程序观察的蛋白酶处理的样品未显示有任何凝胶状有机物质。这表明从壳片段中浸出的物质是蛋白质。从Pereira-Mouries等人[21]的著作中可以知道蛋白质是丝状的。

酸性蛋白质：酸性蛋白质在钙存在条件下构象呈beta;-片状，因而它们可能是在X射线和电子衍射图案中观察到的蛋白质beta;-片反射的蛋白质[7,8]。我们还注意到，测量的beta;-片之间的d间距大于丝素中预期的d间距，并且其与具有较大侧链基团的蛋白质（例如富含天冬氨酸的酸性蛋白质）很相容。研究已经获得了很多来自珍珠质的蛋白质序列[4]，但迄今为止，这些都不是异常酸性的。真正酸性基质蛋白的第一序列来自棱柱状的方解石层[25-27]。他们有明确定义的域名，其中一些是带高电荷的。即使没有镁，珍珠层中的一些异常酸性蛋白质

也能够在体外选择性地使文石成核，而不是方解石[23,28,29] 。我们已经制备出了针对文石成核酸性蛋白质级分的多克隆抗体，并使用这些抗体显示酸性蛋白质部分的一些组分位于发生晶体成核的矿物多边形的中心（图3C）[30]。在单个文石晶片下的基质表面的组织化学作图显示，在头足类鹦鹉螺珍珠中，成核位点包含有被硫酸基团环包围的羧酸基团核[30,31]。有趣的是，在成熟的珍珠母片中描绘有与鹦鹉螺化学图谱区域大小相当的双壳类牛角蛤区域：在暴露于地幔细胞的一侧被凸起，而它们在相对侧是凹的（图3A和B）。

图3.在文石片上可以检测到不同的区域并且在牛角蛤的有机基质上似乎反映了珍珠片形成的阶段。 A，B）牛角蛤珍珠表面平行于壳层断裂的SEM图像，显示的是珍珠片的形貌。在两个不同的断裂表面上以不同的放大率拍摄图像，两个断裂表面都面向地幔（成核侧）。可以检测到至少有四个具有不同形貌的区域：600nm中央粗糙凹进区域（箭头）被更高的六边形平台（白色箭头）包围。具有相同六边形轮廓的下部平台围绕后者（白色箭头）。从这个平台的边界到多边形的边界（黑色箭头），填充材料（星星）处于更低的高度。在珍珠片的背面（未示出）观察到生长环结构的阴影印记。 C）来自A. rigida的脱钙珍珠层的层间片的荧光显微照片。用针对珍珠质提取物的酸性文石成核部分产生的多克隆抗体对珍珠片进行染色。蛋白质主要位于晶体印记的中心，其可能是成核位点（箭头）和间隙基质即相邻片剂之间的边界（箭头）[30]。

矿物质：来自成熟珍珠质的矿物片衍生为文石的单晶[32,33]。片层的平均体积为10*10*0.5 mm=50 mm 3 .。 为了沉积50 mm 3的文石（密度为2.96gcm -3，溶解度常数为10-8.22m 2），所需的饱和碳酸钙溶液的体积比沉积的矿物体积大至少105倍。 这显然体现了矿化时存在的将足够的矿物运输到矿化地点之后去除大量的水的问题。 这个问题有一种可能的解决方案是在其他地方形成初始矿物相，然后将其运输到矿化位置。

已经在软体动物的许多不同组织中观察到特定细胞内含有矿物质的囊泡（Watabe等[34]综述），包括被认为参与矿化的血液（血淋巴）细胞[34,35]。Watabe等人[34]报道大多数这些囊泡中的矿物相是无定形碳酸钙或球霰石，两者都是高度不稳定的。他们的壳再生研究中得出结论，矿物相是被溶解并运输到壳形成的位置的，而这些囊泡颗粒起到离子存储位点的作用。已经发现有其他形式的储存颗粒，包括载有钙的磷蛋白[36]。然而，Neff [37]观察到地幔上皮细胞中含有矿物质的颗粒可直接形成壳。这些颗粒比储存颗粒小得多，并且可以完整地运输到矿化地点。 这些颗粒不产生电子衍射图案，因而可以是由无定形碳酸钙组成。

目前尚不清楚首先在软体动物幼虫壳中沉积的无定形碳酸钙矿物质一开始就有，还是从其他地点运输进来[10]。如果是后者，无论矿物相是以固相还是高浓度液相运输进来，上面提到的矿化时存在的问题都会大大减轻。如果囊泡仅载有钙，那么所需要的大量的碳酸盐无法被输送进来。 尽管已经鉴定出至少一种具有与珍珠质相关的碳酸酐酶活性的

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