从新分离的芽孢杆菌中筛选产胞外蛋白酶的菌株外文翻译资料

 2023-01-04 10:01

从新分离的芽孢杆菌中筛选产胞外蛋白酶的菌株

Hanan S. Alnahdi

生物化学系，女子科学学院，阿卜杜勒阿齐兹国王大学，吉达，沙特阿拉伯

摘要：众所周知，细菌具有将酶分泌到环境中的能力。芽孢杆菌是重要的工业生物，它能够产生包括蛋白酶在内的广泛的细胞外酶。由于它能产生蛋白酶，而将其从沙特阿拉伯收集的海洋样本中分离出来。本项工作的目的是评估从海洋样本中分离出来的不同细菌的蛋白酶产生能力。筛选出了六种产蛋白酶菌株。在明胶水解的基础上，选择两种产蛋白酶的菌株2号和3号。当用发酵生产培养基检测胞外蛋白酶时，发现在2号菌株记录的日期中，细胞外蛋白酶产量达到了最高（243 U/ml）。最终，选择这个菌株进行了形态特征的鉴定，并将其命名为芽孢杆菌2号 EHN。

关键词：蛋白酶；细胞外；酶；筛选；分离；鉴定；明胶；芽孢杆菌

引言

蛋白质是一类酶，它具有催化功能，能够水解蛋白质中的肽键，并将它们分解成多肽或游离氨基酸，占了全球工业酶市场的59%，并有望在2012年超越29亿美元（Deng等人，2010）。他们在洗涤业、皮革业、食品业、医疗工业具有广泛的商业用途（Bhaskar等，2007和Jellouli等人，2009）。蛋白酶的来源包括所有生命形式，即植物、动物、微生物。基于它们的的酸碱特性，蛋白酶分为三种，即酸性、中性和碱性蛋白酶。酸性蛋白酶在pH值2.0 - 5.0范围内活性最高并且主要由真菌产生。而最佳活性在pH值7.0及左右的蛋白酶称为中性蛋白酶，主要来源于植物。而在pH值8.0及以上范围具有最佳活性，由微生物产生的蛋白酶被分类为碱性蛋白酶。由微生物产生的蛋白酶在例如洗涤剂、制革业、摄影行业、制药业和废物处理等许多行业发挥重要作用（Gupta等，2002）。蛋白酶在自然界中广泛存在，微生物凭借其快速生长而成为这些酶的首选来源，它们的培养不需要太多的空间，并且容易通过遗传操作，从而产生特性改变的新酶，这些酶具有各种很好的应用前景（Kocher和Mishra，2009）。芽孢杆菌是一种菌属，它能产生包含蛋白酶在内的多种细胞外酶，例如蜡状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌（Shumi等人.2004）。“芽孢杆菌属”在工业上是碱性蛋白酶的重要来源，并且可能是商业上用于碱性蛋白酶生产的唯一一种菌属（Ferrari等，1993）。它们广泛分布于土壤和水中，某些菌株可耐受包括高碱性在内的极端环境条件。需要高pH值以达到其最佳酶活性则是决定蛋白酶工业适用性的最重要特征之一，从不同生态环境中筛选出能产生蛋白酶的芽孢杆菌，可以分离出具有独特生理化学特征的新碱性蛋白酶（Singh等，1999）。在本文中，我们的目的是从沙特阿拉伯当地的海洋样本中分离出产生蛋白酶的新来源以及探索蛋白酶在工业中的潜在应用。

材料和方法

样本来源

利用无菌容器从沙特阿拉伯吉达的红海沿岸收集的海水以及海洋淤泥的样本（30米深）。

细菌的分离

根据Sjodahl等人（2002）描述的连续稀释法对产蛋白酶的细菌进行分离。将样本接种在用海水制备的脱脂牛奶琼脂平板上,平板含有蛋白胨（0.1％），NaCl（0.5％）和脱脂牛奶（10％），然后在28plusmn;2℃下培养3天（Uyar等， 2011）。菌株的纯化主要在营养琼脂培养基上，基本维持在4℃，通过菌落形态确定培养纯度。

筛选最佳蛋白酶产生菌株

通过平板实验筛选产生蛋白酶的最佳菌株，使用蛋白酶特异性培养基（g /L），包含K2HPO4 2.0，葡萄糖 1.0，蛋白胨5.0，明胶15.0和琼脂粉15.0。在28℃培养24小时后，通过用氯化汞溶液覆盖平板表面，然后测量透明圈直径，这种方法被称为凝胶透明圈法（Abdel Galil 1992）。

蛋白酶量的估计

将分离菌株接种于50ml蛋白酶特异性肉汤培养基（g/L）：包含葡萄糖5.0;蛋白胨7.5;(MgSO4·7H2O,5.0;KH2PO4,5.0和FeSO4·7H2O,0.1，pH-7.0，并在旋转振荡器（180rpm）中于28℃下培养3天。发酵完成后，将整个发酵液在4℃条件下以10,000rpm离心，并回收上清液。对粗酶上清液进行下一步研究（Josephine等，2012）。

酶活力的测量

根据Tsuchida等（1986）的方法，使用酪蛋白作为底物，测定上清培养液中的蛋白酶的活性。配制含有1%（w / v）酪蛋白的50 mM磷酸盐缓冲混合液500mu;l，调节pH 7，并将200mu;L粗酶提取物置于40℃水中温育20分钟。20分钟后，在提起物中加入1ml 10％（w / v）三氯乙酸（TCA）终止酶反应，并在室温下静置15分钟。然后，将反应混合物以10,000rpm离心5分钟，将混合物中未反应的酪蛋白分离。将上清液与2.5ml的0.4M Na2CO3溶液混合，加入1ml 3倍稀释的福林酚试剂。将得到的溶液放置在黑暗环境中，室温条件下显色30分钟，使用酪氨酸标准液作为空白对照，在660nm处测量蓝色物质的吸光度（Lowry等，1951）。在标准条件下，将上清液中每毫升每分钟释放1mu;g酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位。

分离细菌的鉴定

根据Peciulytė（2007）描述的方法进行纯化，将具有高水平产蛋白酶能力的细菌菌株分离出来。最后，根据Buchanan和Gibbons（1974）的方法对分离和纯化后的产酶菌株进行形态学检测、培养条件研究和生化特征鉴定。

结果和分析

从海洋样品中共分离出六种细菌菌株。对所有的6种菌株，都进行蛋白酶的定性（抑菌区）和定量（U / ml）测定。并对能产生最多蛋白酶的最佳菌株进行鉴定。

筛选和分离蛋白水解细菌

使用脱脂牛奶琼脂平板和明胶琼脂平板测定所有菌株的蛋白水解活性，其活性大小通过透明圈的直径表现出来。对于蛋白酶的定性测试，明胶琼脂相比脱脂牛奶琼脂更好。如图（1）所示，在6株菌株中， 2号和3号菌株显示出高水平蛋白水解活性。Gupta等人（2005）从

图1 明胶琼脂平板上2号和3号菌株的透明圈

环境样本中分离了细菌菌株，并使用脱脂牛奶琼脂平板对它们产生蛋白酶的能力进行筛选，并报道，在分离菌株中，链霉素菌CD3能产生最多的蛋白酶。Chekireb等人（2009）通过在明胶琼脂平板中生长的真菌周围形成的透明圈，从手头的70种真菌中筛选具有产细胞外蛋白酶的能力的菌株。

细胞外蛋白酶的定量分析

本研究的目的是选择具有高水平产蛋白酶能力的细菌菌株。为了达到目的，我们在初步筛选期间在明胶琼脂培养基上进行了选择，总共分离出6种不同的细菌菌株。在液体培养基中对六种菌株的胞外蛋白酶进行定量检测试验。表（1）清楚地显示，所有被研究的细菌都分泌出不同水平的蛋白酶。72小时后， 2号菌株蛋白酶活性达到最大值（243U/ml）。实验发现蛋白酶最高产量发生在指数期结束时。其他三个菌株，4号，5号和6号显示出较高的细胞外蛋白酶活性（分别为155, 175和149 U/ml）。1号和3号菌株分别观察到最低的胞外蛋白酶活性（55和75 U/ml）。

表 1：生产培养基中不同菌株的蛋白酶活性。

菌株 编号

光密度

酶活性（U / ml）

菌株1

0.266

55

菌株2

1.17

243

菌株3

0.362

75

菌株4

0.747

155

菌株5

0.825

171

菌株6

0.716

149

目前已经进行了许多用于蛋白酶生产的新菌株的筛选研究。其他投资者，报道了炭疽杆菌S-44和蜡状芽孢杆菌S-98，都在培养60小时内都表现出最大的蛋白酶生物合成的能力，此时炭疽芽孢杆菌S-44的生产力达到126.09 U/ ml-1，而相对应于蜡状芽孢杆菌S-98则为240.45 U/ml-1 （（Johnvesly等，2012）。另一方面，在14种菌株中，Endhatia parasitica和Muco.Miehei发现了最大蛋白酶的产量，其范围在5.1至369U / ml之间（Brown等，1991）。

图2 革兰氏阳性杆状芽孢杆菌菌株

产蛋白酶细菌的鉴定

从海洋中分离出产生蛋白酶的细菌菌株中，其中2号菌株显示出最高的蛋白酶生产能力。基于形态学特征对潜在的细菌进行鉴定。其形态特征如图（2）所示。结果表明，2号菌株是一种运动的，革兰氏阳性的，杆状的，含有芽孢的细菌，它被鉴定为芽孢杆菌菌株（Kim等，1998），并将其命名为芽孢杆菌2 EHN。

致谢

作者对Nadia A. Abdelmajeed博士（生物化学系，女子科学学院，阿卜杜勒阿齐兹国王大学，沙特阿拉伯吉达）的设备、 以及不断的鼓励和Enas N. Danial博士（生物化学系，女子科学学院，阿卜杜勒阿齐兹国王大学，沙特阿拉伯吉达）的帮助工作以及对手稿的批改阅读表达感谢。

参考文献

[1]Abdel Galil O A: Fermation of proteases by Aspergillus fumigates and pencillium sp. J.king. Saud. Univ. 1992; 4 (2):127-136

[2]Bhaskar N, Sudeepa ES, Rashmi HN and Selvi AT: Partial purification and characterization of protease of Bacillus proteolyticusCFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities. Bioresour. Technol. 2007; 98: 2758-2764.

[3]Brown ED and Yada RY: Spin-labelling and differential scanning colorimetry study of the denaturation of aspartic pectinases from the fungi Endhatia parasitica and Mucor. Miehei. Agric. Biol. Chem. 1991; 55: 1639-1641.

[4]Buchanan RE and Gibbons NE: Bergeyrsquo;s Manual of Determinative Bacteriology, 8 th edition. Baltimore, The Williams and Wilkins Co. 1974; 15-36

[5]Chekireb D, Tahar A and Cochet N: Acid Protease Production by Isolated Species of Penicillium. European Journal of Scientific Research 2009; 25: (3) 469-477

[6]Deng A, WU J, Zhang Y, Zhang G and Wen T: Purification and characterization of a surfactant-stable high-alkaline protease from Bacillus sp. B001. Bioresour. Technol. 2010; 1

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