纤维单胞菌parahominis MB426中 L-核糖异构酶基因的克隆和鉴定外文翻译资料

 2022-03-22 09:03

Journal of Bioscience and Bioengineering

VOL. 115 No. 4, 377-381, 2013

www.elsevier.com/locate/jbiosc

Cloning and characterization of the L-ribose isomerase gene from

Cellulomonas parahominis MB426

Kenji Morimoto,y Yuji Terami,y Yu-ichiro Maeda, Akihide Yoshihara, Goro Takata,* and Ken Izumori

Rare Sugar Research Center, Kagawa University, Miki-cho, Kagawa 761-0795, Japan

Received 26 July 2012; accepted 24 October 2012

Available online 1 December 2012

A newly isolated bacterium, Cellulomonas parahominis MB426, produced L-ribose isomerase (CeLRI) on a medium containing L-ribose as a sole carbon source. A 32 kDa protein isomerizing L-ribose to L-ribulose was purified to homogeneity from this bacterium. A set of degenerated primers were synthesized based on amino acid sequences of the purified CeLRI, and a 747 bp gene encoding CeLRI was cloned, sequenced and overexpressed in Escherichia coli. This gene encoded a 249 amino acid protein with a calculated molecular mass of 27,435. The deduced amino acid sequence of this gene showed the highest identity with L-ribose isomerase from Acinetobacter calcoaceticus DL-28 (71%). The recombinant L-ribose isomerase (rCeLRI) was optimally active at pH 9.0 and 40 C, and was stable up to 40 C for 1 h and not dependent for metallic ions for its activity. The rCeLRI showed widely substrate specificity for the rare sugar which involved L-erythro form such as L-ribose, D-lyxose, D-talose, D-mannose, L-gulose, and L-allose.

copy;2012, The Society for Biotechnology, Japan. All rights reserved.

[Key words: Rare sugar; L-Ribose isomerase; Cellulomonas parahominis; L-Ribose]

Monosaccharides and their derivatives which hardly exist in nature are so-called “rare sugars”. There is little knowledge of their biological and physiological functions for rare sugars so far. Therefore, to investigate them, we are working on production of various kinds of rare sugars using microorganisms and their enzymes (1-4).

It is well-known many organisms prefer to utilize the D-formed enantiomer of D-ribose and 2-deoxy-D-ribose as a sugar unit of nucleic acids, by contrast, L-formed enantiomer of them, L-ribose and 2-deoxy-L-ribose are not abundant in nature. However, they are a potential starting material for the synthesis of many L-nucleoside-based pharmaceutical compounds. For instance, the L-formed enantiomers of nucleoside analogs have been used as antiviral drugs in treatments of several viral diseases, such as those caused by the HIV or hepatitis virus (5-9). Furthermore, oligonucleotides composed of 2-deoxy-L-ribose are resistant to digestion by certain nucleases (10,11). Since L-ribose can be used as a precursor for the synthesis of most of this compound (12), establishment of an effi-cient L-ribose synthesis method is strongly desirable.

Methods of L-ribose and 2-deoxy-L-ribose production by chemical synthesis are included in expensive regents, many steps, and organic solvents (10-13). Thus, methods are very difficult to produce scale-up industrially, and keep safety for health. Hence, we developed a process for L-ribose production by biotechnological method, which has easily and simply converted ribitol to L-ribose

* Corresponding author. Tel.: thorn;81 87 891 3106; fax: thorn;81 87 891 3289. E-mail address: goro@ag.kagawa-u.ac.jp (G. Takata).

y These authors contributed equally to this work.

by just two steps (14). The first step is oxidation of ribitol to L-ribulose by microbial reaction using rested Acetobacter aceti NBRC 3281 cells. Ribitol is easily and cheaply produce from D-ribose by hydrogenation due to reductant. And second step is isomerization of produced L-ribulose by L-ribose isomerase from Acinetobacter calcoaceticus DL-28 (AcLRI) (15-17). Molecular study of rare sugar producing enzymes is also very important for improvement of enzymatic properties by DNA manipulation, and useful for appli-cation of these enzymes for rare sugar production (18,19). Although, thermal stability of AcLRI was extremely low, we had cloned its gene and deduced amino acid sequence, and over-expression in Escherichia coli (15,20). We could prepare much more recombinant L-ribose isomerase (rAcLRI) protein easily, however thermal stability of this recombinant enzyme remained in less than 30 C as well as wild type enzyme, suggested that this rAcLRI was not suitable for more efficient production of rare sugars. Consequently, it is of interest to discover a novel thermoactive and thermostable L-ribose isomerase.

In order to investigate higher thermostable stable L-ribose isomerase, Cellulomonas parahominis MB426 which produced inductive L-ribose isomerase was isolated from soil and described the cloning and sequencing of this gene and its expression in E. coli following purification of this enzyme in this study.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains and vectors C. parahominis MB426 were isolated from a soil using mineral salt medium composed of 0.26% (NH4)2SO4, 0.24% KH2PO4, 0.56% K2HPO4, 0.01% MgSO4·7H2O, 0.05% yeast extract, and 0.5% L-ribose as a carbon source. E. coli JM109 cells and plasmid vector pT7blue T-vector (Merck KGaA,

1389-1723/$ e see front matter 2012, Th

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纤维单胞菌parahominis MB426中

L-核糖异构酶基因的克隆和鉴定

Kenji Morimoto, Yuji Terami, Yu-ichiro Maeda, Akihide Yoshihara,

Goro Takata, and Ken Izumori

日本香川三一町香川大学罕见糖研究中心761-0795

收到2012年7月26日; 接受2012年10月24日

2012年12月1日网上可用

摘要：一种新分离的细菌，纤维单胞菌parahominis MB426，在含有L-核糖作为唯一碳源的培养基上产生L-核糖异构酶（CeLRI）。该细菌中一段32 kDa蛋白质将L-核糖异构化为L-核酮糖并纯化。 基于纯化的CeLRI的氨基酸序列合成一组简并引物，编码CeLRI的747bp基因克隆，测序并在大肠杆菌中过表达。该基因编码249个氨基酸的蛋白质，计算分子量为27,435。该基因的推导氨基酸序列显示与不动杆菌醋酸钙DL-28（71%）的L-核糖异构酶具有最高同一性。重组L-核糖异构酶（rCeLRI）在pH 9.0和40℃下是最佳活性的，并且在40℃下稳定1小时，并且不依赖于金属离子的活性。rCeLRI显示了涉及L-erythro形式的稀有糖的广泛底物特异性，例如L-核糖，D-来苏糖，D-塔洛糖，D-甘露糖，L-古洛糖和L-阿洛糖。

copy; 2012年，日本生物技术协会。 版权所有。

关键词：稀有糖；L-核糖异构酶；纤维单胞菌parahominis；L-核糖

自然界中几乎不存在的单糖及其衍生物是所谓的“稀有糖”。到目前为止，对于稀有糖类的生物和生理功能知之甚少。因此，为了调查这些，我们正在研究生产使用微生物及其酶的各种稀有糖（1-4）。

众所周知，许多生物优选利用D-核糖和2-脱氧-D-核糖的D-形式的对映异构体作为核酸的糖单元，相比之下，它们的L-形式的对映异构体，L-核糖和2 脱氧-L-核糖在本质上不是丰富的。然而，它们是合成许多L-核苷类药物化合物的潜在起始物质。例如，核苷类似物的L型形成的对映异构体已被用作抗病毒药物，用于治疗几种病毒性疾病，例如由HIV或肝炎病毒引起的那些（5-9）。此外，由2-脱氧-L-核糖组成的寡核苷酸对某些核酸酶的消化具有抗性（10,11）。由于L-核糖可以用作合成大部分化合物（12）的前体，因此强烈希望建立有效的L-核糖合成方法。

通过化学合成生产L-核糖和2-脱氧-L-核糖的方法包括在昂贵的试剂，许多步骤和有机溶剂中（10-13）。因此该方法很难在工业上进行放大，并保持健康的安全。所以，我们开发了一种通过生物技术进行L-核糖生产的方法，只需两步即可将核糖醇简单地转化为L-核糖（14）。第一步是使用有活力的醋酸杆菌NBRC 3281细胞，通过微生物反应将核糖醇氧化成L-核酮糖。由于还原剂，核糖醇可通过氢化容易且廉价地从D-核糖产生。第二步是通过醋酸不动杆菌DL-28产生的L-核糖异构酶（AcLRI）将L-核酮糖异构化（15-17）。稀有糖生产酶的分子研究对于通过DNA操作改善酶特性也是非常重要的，并且可用于这些用于稀有糖生产的酶的应用（18,19）。虽然AcLRI的热稳定性非常低，但我们克隆了其基因并推导出氨基酸序列，并在大肠杆菌中过表达（15,20）。我们可以很容易地制备出更多的重组L-核糖异构酶（rAcLRI）蛋白，但是该重组酶的热稳定性和野生型酶一样小于30℃，表明该rAcLRI不适合于更有效地生产稀有糖。因此，发现一种新的热活性和热稳定的L-核糖异构酶是有意义的。

为了研究高耐热稳定L-核糖异构酶，本研究从土壤中分离出产生诱导性L-核糖异构酶的纤维单胞菌parahominis MB426，并描述了该基因的克隆和测序及其在大肠杆菌中的表达。

材料与方法

细菌菌株与载体 使用无机盐培养基（0.26 % (NH4)2SO4, 0.24 % KH2PO4, 0.56 % K2HPO4, 0.01 % MgSO4·7H2O, 0.05 % 酵母抽提物, 0.5 % L-核糖作为碳源）从土壤中分离出C.parahominis MB426。大肠杆菌JM109细胞和质粒载体pT7blue T载体（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）用于DNA操作。质粒载体pQE30载体（Qiagen，Valencia，CA，USA）和大肠杆菌JM109用于来自C. Parahominis MB426的L-核糖异构酶基因的异源表达。

培养条件 使用DNA操作的C.phohominis MB426在胰蛋白酶大豆肉汤（Becton Dickinson and Company，NJ，USA）培养基上在100 mL锥形瓶中于37℃培养24小时。为了从野生型（CeLRI）中纯化L-核糖异构酶，将C.Phohominis MB426在含有0.1%D-来苏糖的胰蛋白胨大豆肉汤培养基上在5 L发酵罐中于37℃培养24小时。 在5 L发酵罐中，将大肠杆菌JM109细胞在由3.5%细菌胰蛋白胨，2%酵母提取物和0.5%NaCl组成的超级培养基培养基上在30℃培养12小时。 当培养物在600 nm处达到光密度为0.7时，通过加入1 mM IPTG引发重组蛋白质表达，然后在30℃下再继续4小时。

CeLRI基因的克隆 根据后述的CeLRI的N末端和内部氨基酸序列，设计了两个简并寡核苷酸引物F1-pro和R1-pro（表1）（Invitrogen，CA，USA）合成DNA探针。使用这些引物，通过聚合酶链式反应（PCR）DIG Probe Synthesis试剂盒（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）将衍生的C.Phohominis MB426的CeLRI基因的一部分用来自染色体DNA的地高辛(DIG)-11-dUTP一个协议使用等量的C.Phohominis MB426染色体DNA（每个泳道10 mg）用几种限制酶和1.0 mg标记的探针消化进行Southern杂交。 Southern杂交后，通过反向PCR扩增邻近CeLRI基因的未知DNA片段（21）。基于DIG标记探针的核苷酸序列设计了两个简并寡核苷酸引物：F2-inv和R2-inv（表1）。染色体DNA用适当的限制酶消化，含有靶基因的DNA片段用DNA连接试剂盒（Takara Shuzo，Japan）自连接，并在TaKaRa PCR热循环仪（Takara Shuzo）中进行PCR。将扩增反应混合物（20 mL）组合物设计为KOD FX Neo（Toyobo，Japan）方案，循环参数为94℃ 2分钟，随后进行30次循环，98℃ 10秒，60℃ 30秒，68℃ 1分钟。

DNA测序 将含有完整的CeLL基因的DNA片段与pT7blue T载体连接，并导入大肠杆菌JM109细胞。根据CEQ 8800遗传分析系统（Beckman coulter）的制造商说明书，使用CEQ DTCS快速启动试剂盒（Beckman Coulter，CA，USA），通过双脱氧核苷酸链终止法（22）测定DNA序列。 使用基本的局部比对检索工具（BLAST）从DDBJ数据库中比较氨基酸序列。

CeLRI的过表达 为了促进和最小化纯化步骤，我们构建了其中涉及CeLRI蛋白的融合蛋白。通过将片段连接到质粒pQE30中构建表达质粒，其将靶向蛋白质的N末端中的六个组氨酸亲和标签融合。将染色体DNA用于PCR操作的模板以扩增完整的CeLRI基因。基于阐明的核苷酸序列设计了两个合成的寡核苷酸引物：F3-Bam和R3-Hin（表1）。如上所述通过PCR条件进行PCR扩增。将扩增的DNA用含有CeLRI基因整个编码序列的BamHI和HindIII消化，并插入设计pBHRI的pQE30中，将构建的质粒导入大肠杆菌JM109。

CeLRI和重组L-核糖异构酶（rCeLRI）的纯化 通过在4℃下以10,000 rpm离心10分钟收集C.Phohominis MB426细胞，并用50 mM Trise HCl缓冲液（pH 7.5）洗涤两次，并在4℃下通过超声处理（Branson Sonifier 450，Dunbury，CT，USA）破碎，再4℃以15,000 rpm离心30分钟除去细胞碎片。将其上清液用作粗提物以纯化CeLRI。除非另有说明，否则使用预填充柱（GE Healthcare Bioscience，NJ，USA），用AKTA净化器纯化CeLRI。首先将来自野生型的粗CeLRI应用于HiLoad 16/10 Q Sepharose HP柱（1.6times;2.5 cm，GE Healthcare Bioscience）。用(NH4)2SO4（4 M）饱和的高水平CeLRI活性的混合级分和酶溶液第二次施用Resource PHE柱（1.6times;3.0 cm，GE Healthcare Bioscience）。将具有高水平CeLRI活性的合并级分第三次进行Resource Q柱（1.6times;3.0 cm，GE Healthcare Bioscience）。

用50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）制备含有pBHRI的重组大肠杆菌JM109细胞。 该粗品rCeLRI首先用于His Trap HP色谱柱（1.6times;2.5 cm，GE Healthcare Bioscience）。 该酶第二次应用于Resource Q柱（1.6plusmn;3.0 cm，GE Healthcare Bioscience）。

分析每个纯化步骤的级分，以根据Laemmli（23）的方法检测十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）的纯化进程。 为了研究内部氨基酸序列，用CNBr消化纯化的CeLRI，然后使用使用491蛋白测序仪的自动Edman降解方法将片段电印迹到用于内部氨基酸序列确定的聚偏二氟乙烯膜上（Applied Biosystems，CA，USA）。

酶活性和蛋白质测定 L-核糖用作酶活性测定的底物。 通过测量含有50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0）的反应混合物中的酮糖，L-核酮糖的增加和适量的酶的终体积为0.5 mL来测定异构酶活性。 通过在60℃下配备有折射率（RI）检测器（Shimadzu RID-10A）和分离柱（GL-C611，Hitachi，Japan）的HPLC系统（Shimadzu CBM-20A，Japan） 用10 -4 M NaOH以1.0 mL/min的流速洗脱和半胱氨酸-咔唑法测定L-核酮糖的形成（20,24）。 酶的单位定义为在1分钟内将1 mmol醛糖转化成酮糖的量。

酶学性质测定 为了测定pH和温度的影响，在40℃，pH 3.0-11.0，然后在pH 9，0-80℃范围内，分别通过半胱氨酸-咔唑法测定L-核糖异构酶活性。此外，通过上述方法在几种金属离子（无，KCl，MgCl2，MnCl2，CaCl2，ZnCl2，BaCl2，CuCl2，NiCl2，LiCl，AgNO3和FeCl2）存在下研究酶活性，终浓度为1.0 mM。然后，使用50 mM每个底物浓度来研究酶的底物特异性。在含有底物（D/L-核糖，D/L-来苏糖，D/L-谷糖，D/L-阿洛糖，D/L-古洛糖，D/D-甘露糖，D/L-阿拉伯糖，D/L-木糖，D/L-阿卓糖，D/L-葡萄糖，D/L-阿糖，D/L-半乳糖）的50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0）中测量rCeLRI活性。反应混合物在40℃下孵育10分钟，通过半胱氨酸-咔唑法测定酮糖的形成。在50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0）中测定rCeLRI的动力学参数，通过半胱氨酸-咔唑法测定每种200 mM底物。使用Lineweaver-Burk印迹计算底物的动力学参数，如Km（mM）和Vmax（mu;mol/min/mg-蛋白质）。

CeLRI的纯化和酶学性质 根据材料和方法培养C. Parahominis MB426细胞，通过三步柱色谱纯化CeLRI（表2）。最后将酶纯化27倍，回收率为30%。 比活性为39.5 U/mg。 纯化的酶通过SDS-PAGE证实为单条带（32 kDa）（数据未显示），并且CeLRI的分子量估计为32,000。 该酶在40℃在50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0）中优化。 纯化的CeLRI的N末端和内部氨基酸残基被鉴定为IVHPGKFCP，PEGSLHAEGV和PEGSLHAERV。

CeLRI基因的克隆 基于内部氨基酸序列，通过使

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