15N-cholamine—一种可结合NMR和MS技术的代谢物分析智能同位素标记物外文翻译资料

 2022-08-10 03:08

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15N-cholamine—一种可结合NMR和MS技术的代谢物分析智能同位素标记物

摘要：近来，由于有化学选择性的同位素标记法具有更高的分辨率和灵敏度，使得出现了新的放大的方法来检测生物流体中的上百种可量化代谢物，比如运用核磁共振（NMR）光谱法或者质谱法（MS）。然而，对于相同代谢物的检测分析，无法同时使用这两种补充分析技术，这阻碍了对来自于两个平台数据的相关性的研究，从而不能最大限度地发挥它们在应用方面的综合优势，例如在生物标志物的发现和未知代谢物的鉴定方面。为了让缓解这一瓶颈，我们描述了一种智能同位素标记物—15N-cholamine，它具有两个重要特性：NMR敏感同位素和MS敏感永久电荷。利用该标记物，我们检测证明在人体血清和尿液中都含有羧基代谢物。通过结合15N标记和永久电荷的独特优势，智能同位素标记物有助于同时运用两种分析方法来有效检测含羧基的代谢物。本研究阐明了一种应用于代谢组学领域的独特方法，可最大限度地发掘MS和NMR技术的综合应用优势。

在过去的几十年里，代谢组学领域呈指数级发展，这是因为它具有对系统生物学研究的能力和在众多领域的潜在应用，包括生物医学、毒理学、食品营养学、药物开发和环境科学。常用分析技术例如核磁共振（NMR）光谱法和/或者质谱法（MS）可以满足对解决生物混合物的复杂性和识别大量可量化代谢物的高需求。然而，尽管取得了许多进步，但生物学的复杂性往往还是超过了这些先进分析方法的能力；目前，没有一项技术能够在单个实验中检测所有代谢产物。每种分析方法都对特定种类的代谢物敏感，并且取决于目标代谢物的性质，通常使用一种或有时将NMR或MS技术结合用于分析尽可能多的代谢物，从而获得生物学意义。这种方法的主要障碍是，从NMR和LC-MS或GC-MS方法获得的相同或相似样品的代谢物数据通常无法直接比较。无法比较和关联来自相同或相似样品的不同分析技术的数据是一项重大挑战，这将使得无法从文献中现有的大量代谢物数据得出有意义的结论，以及无法充分利用NMR和MS的结合优势来分析鉴定未知代谢物。造成此瓶颈的主要因素是有限的NMR灵敏度、复杂的光谱特征和可变的MS电离效率或抑制作用。

化学选择性标记物的使用提供了一种途径来提高代谢物检测的灵敏度，即通过共同使用NMR和MS方法。例如，使用含有永久电荷的化学选择性标记的代谢物，可将MS检测的灵敏度提高三个数量级或更多。由于存在永久电荷，因此无论在采用MS检测之前用于分离代谢物的溶剂的pH值或性质如何，被标记的代谢物都能以高灵敏度和更好的定量准确度来有效检测。另外，基于使用12C / 13C-丹磺酰氯进行的不同丹磺酰化，已实现了对胺和苯酚代谢物的绝对或相对定量，并且使得灵敏度提高了3个数量级。同样，基于NMR敏感同位素的化学选择性标记物已经显示出可通过NMR以高灵敏度和分离度检测到许多可定量的代谢物。例如，使用15N-乙醇胺作为标记物，通过1H-15N二维NMR以高分辨率和灵敏度检测到了一百多种含羧基的代谢物。然而，尽管MS和NMR分别使用化学选择性标记物都能以高灵敏度检测代谢物，但是无法比较和关联两种方法的数据是代谢组学领域的主要瓶颈。

通过共同使用NMR和MS方法可以更容易地检测相同代谢物，这种能力将为比较MS和NMR平台之间的数据以及充分利用两种互补方法的综合优势提供了新途径。为了实现这一目标，我们引入了一种新的“智能同位素标记”方法，即使用15N-cholamine，其通过同位素富集而具有高的NMR灵敏度和分辨率，并通过其永久性正电荷而具有高的MS灵敏度（请参见图1）。该标记物结合了先前分别用于NMR和MS检测的单独化学选择性标记物的优势，并提供了新的方法来充分发挥这些强大、互补的技术之间的结合优势，应用于代谢物谱分析和未知代谢物鉴定等领域。

图1：说明“智能同位素标记”方法的示意图，该方法用于以高灵敏度使用NMR和MS检测相同的代谢物。用NMR和MS检测15N-cholamine标记的含羧基的代谢物都增强了检测能力。

实验部分

化学品和生物流体：总共48种含羧基的代谢物标准品（表I），（2-溴乙基）-三甲基溴化胺，二甲基甲酰胺（DMF），甲醇，乙腈，丙酮，盐酸（HCl），氢氧化钠（NaOH）（均来自Sigma- Aldrich，密苏里州圣路易斯），4-（4,6-二甲氧基[1,3,5]三嗪-2-基）-4-甲基吗啉氯化物（DMTMM）（Acros Organic，宾夕法尼亚州匹兹堡），15N-邻苯二甲酰亚胺钾和氧化氘（Cambridge Isotope Laboratories，安德弗，马萨诸塞州）无需进一步纯化即可使用。根据普渡大学的内部审查委员会，从Innovative Research，Inc.（密西根州诺维）获得人血清样品，并从健康志愿者那里获得尿液。去离子（DI）水来自Millipore（马萨诸塞州比尔里卡）的内部协同超纯水系统。

表I：15N-cholamine标记的含羧基代谢物的1 H和15 N-NMR化学位移（参考智能标记的甲酸）

智能同位素标记物—15N-cholamine的设计与合成：15N-cholamine的合成涉及两步反应，并遵循盖布瑞尔（Gabriel）合成法，并如下所述进行修饰以产生纯产物。第一步包括将15N-邻苯二甲酰亚胺钾与（2-溴乙基）三甲基溴化胺在DMF中反应，以获得15N-取代的邻苯二甲酰亚胺中间体（方案1）。第二步包括15N-取代的邻苯二甲酰亚胺的碱性和酸性水解，以生成智能同位素标签15N-cholamine（方案2）。

简而言之，为了合成15N-取代的邻苯二甲酰亚胺（方案1），将（2-溴乙基）三甲基溴化铵（9.5 mmol，2.35 g）与15N-邻苯二甲酰亚胺钾（10 mmol，1.86 g）在250 mL圆底烧瓶中中混合，在氮气条件下加入干燥的DMF（100mL）。然后将混合物在100℃下搅拌回流12小时。从反应混合物中分离出上清液，并用旋转蒸发仪除去溶剂。所得的粗产物用乙腈洗涤三次（每次5 mL），用丙酮洗涤两次（每次2 mL），然后再次用乙腈洗涤一次（3 mL），得到纯净的15N-取代的邻苯二甲酰亚胺。每一步使用D2O中的1H NMR光谱监测来评估中间产物的纯度。为了合成15N-cholamine，在第二步中，将15N-取代的邻苯二甲酰亚胺（538 mg）（方案1）溶于去离子水中（24 mL）；向溶液中加入1 N NaOH（2.69 mL），并将混合物在室温下搅拌30分钟以完成碱性水解（方案2）。随后，向溶液中加入12 N HCl（1.8 mL），温度升至70°C，在搅拌下放置12小时以完成酸性水解（方案2）。然后使用旋转蒸发仪除去溶剂。将得到的粗产物用乙腈洗涤三次（每次4 mL），然后用25:75的水/丙酮混合液洗涤三次（每次2 mL），得到纯产品，15N-cholamine。每一步使用D2O中的1H NMR光谱监测来评估最终产物的纯度。

使用智能同位素标记物—15N-cholamine来标记代谢物：15N-cholamine（5 mg，50mu;mol）加入微量离心管中的500mu;L样品中，并用1 M HCl或NaOH将混合物的pH调节至7.0。加入21 mg的DMTMM开始反应。将混合物在室温搅拌4小时以完成反应。方案3显示了用智能同位素标记法标记代谢物的一般反应。为保持15N-cholamine质子化，可通过添加1 M HCl或1 M NaOH将pH值调节至5.0，并通过添加去离子水将溶液体积调节至580mu;L。在进行代谢物标记之前，使用甲醇对血清进行脱蛋白处理，并且不进行预处理就使用尿液。

方案1. 15N-取代的邻苯二甲酰亚胺的合成

方案2. 15 N-取代的邻苯二甲酰亚胺的碱性和酸性水解，得到15N-cholamine

方案3.用智能同位素标记物15N-cholamine标记含羧基代谢物的一般反应

NMR：对于每个样品，将580mu;L与30mu;LD2O混合并置于5 mm NMR管中。 NMR实验分别在配有室温探针或冷冻探针的Bruker DRX 500 MHz或Avance III 800光谱仪上进行，适用于298 K的Z梯度1H逆检测。带或不带溶剂信号的一个脉冲序列1H 1D NMR实验使用预饱和进行抑制。灵敏度增强的1H-15N二维异核单量子相干（HSQC）实验采用了6 ms的INEPT传输延迟，对应于90 Hz的JNH。 1H和15N尺寸的频谱宽度分别约为8 kHz和3 kHz。此处，在间接（t1）维度中收集了每个有1024个数据点的128个自由感应衰变，每个增量有1或4个瞬变。通过GARP（全局优化的交替相矩形脉冲）序列可实现直接采集（t2维）中的氮解耦。在将前向线性预测为256或512点后，将生成的2D数据在t1维度中零填充为1024点。在傅立叶变换之前，对两个维度都应用了45°移位的正弦钟形窗口函数。化学位移以一维光谱的TSP的1H信号或HSQC光谱中衍生的甲酸信号（1H的8.05 ppm； 15N的123.93 ppm）为参考。使用了Bruker Topspin 3.0或3.1版软件包来进行NMR数据分析采集或处理。

MS：LC-MS和LC-MS / MS实验使用在线结合的Agilent 1200 SL-LC系统和Agilent 6520 Q-TOF质谱仪（加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司）进行的分析。将样品（8mu;L）注入安捷伦Poroshell 120 EC-C18色谱柱（30 mmtimes;50 mm，2.7mu;m），将其加热到50°C。流速为0.5mL / min。流动相A是在水中的5 mM乙酸胺，流动相B是在ACN中的0.1％水。流动相组成最初在3％B下保持等度1分钟，然后在4分钟内增加到90％B；在90％B下再经过4分钟后，流动相组成又回到3％B。以正模式使用电喷雾电离（ESI），电压为3.5 kV。质量分析仪的扫描范围为50-1000 m / z。自动LC-MS / MS实验的碰撞能量固定在10 V，以预选择的化合物为目标。

结果与讨论

本研究中设计、开发和应用的智能标记物15N-cholamine保留了15N-乙醇胺标记物的所有特征，包括被标记的代谢物在水性介质中的溶解度、源于1H和15N原子核之间进行的有效极化在约90 Hz的1H和15N之间的大的一键J耦合、所得2D NMR光谱中不同代谢物的宽化学位移分散。此外，重要的是，15N-cholamine具有永久的正电荷，这使得无论洗脱介质的pH或溶剂条件（通常在MS检测之前的色谱分离中使用）如何，MS都能有效地对相同的含羧基代谢物进行正模式检测。

15N-cholamine的合成过程分两步进行，并按照Gabriel合成法进行了适当的修饰，得到纯净的产物。如1H NMR谱图所示（支持信息图S1），纯净的中间化合，15N-取代的邻苯二甲酰亚胺，在合成过程的第一步后获得。可以通过其1 H NMR谱图（支持信息图S2；峰在3.16；3.48；3.64 ppm）确定，该化合物的水解产生纯净的15N-cholamine。支持信息图S3中显示了15N-cholamine的准确M​​S和MS / MS光谱，有助于进一步地验证和判断合成的智能同位素标记物和其纯度（m / z = 104.120）。

然后将该化合物用于标记48种代谢物，这些代谢物因其在生物流体中含羧基代谢物而被选为代表各种代谢途径。表1中显示了用15N-cholamine标记后从2D NMR实验获得的1H和15N化学位移数据。由于15N-cholamine和先前使用的15N-乙醇胺仅在其端基上不同，因此用15N-cholamine标记的代谢物在标记效率、可重复性和化学位移值上与使用15N-乙醇胺标记的代谢物相似。

重要的是，正如根据我们实验室前面显示的15N-乙醇胺标记方法所预期的那样，由于血液中通常存在大量的含羧基代谢物，因此人血清中代谢物的15 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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