膀胱癌与正常膀胱细胞中N-聚糖模式的定量聚糖分析方法外文翻译资料

 2022-10-08 10:10

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膀胱癌与正常膀胱细胞中N-聚糖模式的定量聚糖分析方法

摘要

膀胱癌作为人类最常见的癌症之一,其早期(非肌层浸润性阶段)的诊断成为减少死亡率的最有效途径。通常来讲,恶性肿瘤与聚糖表达的变化紧密相关。膀胱癌的糖基化状态,尤其是全球性糖尿病尚未得到充分研究。我们使用凝集素微阵列联合质谱的方法对四种膀胱癌细胞系(KK47,YTS1,J82,T24)以及一种正常膀胱黏膜细胞系(HCV29)中聚糖的表达进行了定量分析和比较。我们使用凝集素微阵列分析法分析糖型的变化,并通过凝集素染色和凝集素印迹的方法进行验证。对于用组织微阵列分析法研究不同阶段糖型间的联系,我们使用凝集素组织化学进行评估。我们通过唾液酸酸化聚糖并用乙酰肼对N-聚糖进行酰胺化衍生,同时使用稳定的12C613C6同位素标记的苯胺对N-聚糖进行还原胺化,然后用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行定量分析。我们用细胞培养条件下的同位素标记的蛋白质组学方法对生物合成N-聚糖相关的蛋白质定量分析,结果表明有十三种糖基转移酶和四种糖苷酶的表达存在显著差异。我们的实验结果表明,相比正常细胞,膀胱癌细胞和组织中的唾液酸化Lewis-x(sLex)寡糖、末端N-乙酰氨基半乳糖和半乳糖以及高甘露糖型的N-聚糖得以更高度表达。膀胱癌细胞显示,核心岩藻糖基化的N-聚糖得以高度表达而末端岩藻糖基化的N-聚糖低表达。上述任何一种糖组的变化都可能与膀胱癌的形成直接相关。

引言

膀胱癌是第五最常见的人类癌症类型,并且其发病率在过去十年中稳步增加。据估算,2013年美国新诊断出74690列膀胱癌,且有15580人死于膀胱癌[1]。在这些膀胱癌患者中,有大于70%的患者处于非肌层浸润性阶段,约25%的患者最初存在肌层浸润。肌层浸润性膀胱癌患者的癌细胞远处转移和预后不良的风险达50%[2]

膀胱癌常用的诊断手段有膀胱内窥镜检查和尿液细胞化学检查。对大部分患者来说,膀胱镜检查是一个痛苦的过程。FDA已经批准了许多用于膀胱癌诊断的分子生物标志物。这些标志物包括可溶性蛋白如膀胱肿瘤相关抗原(BTA)、核基质蛋白22(NMP22)、在固定膀胱上皮细胞上检测出的蛋白质(ImmunoCyt)以及通过荧光原位杂交(UroVysion)检测出的畸变染色体[3,4]。这些生物标志物在早期(非肌层浸润期)阶段检测膀胱癌的能力较差,因此用于膀胱癌早期诊断的新型生物标志物的开发是高度优先的。

糖基化作用是翻译后蛋白最常见的修饰手段之一,而且据估算发生在人体gt; 70%的蛋白质中[5]。糖基化在分子识别和细胞-细胞的粘附中起至关重要的作用,而且糖基化障碍与畸形特征、发育停滞以及各种类型的死亡相关联。异常的蛋白糖基化通常发生在恶性转化期间,并导致特异性肿瘤相关聚糖的表达。癌细胞上异常聚糖的出现通常与肿瘤的分级、侵袭性和转移性相关,而且与总体不良预后相关联[6]。在癌发生期间,糖基化作用的变化出现得非常早,这种变化在可能在检测到细胞增殖或分化前就已出现[7]。迄今为止,人们利用聚糖作为不同类型癌症的生物标记物的尝试仅取得适度成功,主要是因为(i)聚糖纯化和分析中的技术困难以及(ii)分析结果精确度的变化取决于分析方法和设备类型[8,9]

诸多研究表明,膀胱癌的发生与聚糖的异常表达相关。Ishimura等人的研究证明N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)的表达与肿瘤分级或阶段之间的呈负相关[10]。在对患者血清和尿液中的N-聚糖和O-聚糖的糖印迹分析中,Nishimura等人的研究显示几种N-聚糖和O-聚糖发生显著改变[11]。然而,对于人类膀胱癌的定量糖组分析的相关研究很少。

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定量糖组分析是检测

定量糖组分析用于阐明聚糖在生物学途径和疾病发展中的功能,是检测糖蛋白及其相关聚糖的关键。过去的十年,人们在这一领域取得了重大进展,包括了高通量聚糖分析的有效方法:液相色谱(LC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)[12]。其中质谱是聚糖定量分析的强大工具。基于全甲基化、还原胺化以及同位素标签标记的质量移位技术,质谱一步检测法可以对来自不同样品中的给定聚糖的质量差异进行定量分析,例如,聚糖还原同位素标记(GRIR)[13]、通过全甲基化的同位素标记[14]、同位素全反应性标签(iART)、同位素聚糖酰肼标签(IGHT)以及氨基糖与谷氨酰胺的同位素检测(IDAWG)[15-17]。与人类蛋白质相联系的数千种不同的聚糖是临床或科学感兴趣的对象,但目前没有可用的分析方法可以同时将它们全部量化。

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在本研究中,我们整合了凝集素微阵列和质谱的方法用于定量分析膀胱癌细胞系(KK47,YTS1,J82和T24)与正常膀胱粘膜细胞系(HCV29)的糖基表达水平,这些细胞系先前已经用于多种对聚糖和糖缀合物在膀胱癌进展中的功能作用的研究中[18-20]。我们用凝集素微阵列的方法分析糖蛋白的糖型,并通过凝集素染色、凝集素印迹以及免疫组织化学染色的方法对不同的糖型进行证实。为了在一个步骤中表征唾液酸并定量分析N-聚糖,我们开发了GRIL标记方法以衍生酸化过的和终端还原过的N-聚糖。与糖蛋白连接的N-聚糖被乙酰肼胺化并被PNGase F释放。我们将释放于不同细胞的聚糖的还原末端分别用[12C6]-苯胺和[13C6]-苯胺进行衍生化,并通过MALDI-TOF/TOF-MS定量分析衍生化的聚糖。通过同位素标记方法中的氨基酸的稳定同位素标记来定量分析与N-聚糖生物合成相关的糖基转移酶和糖苷酶的表达水平。这种整合策略(如图1概述)允许对膀胱癌进展中改变的N-聚糖模式进行定量比较,并提供关于膀胱癌糖尿病的重要信息。

材料和方法

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细胞系及其培养

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非肌层浸润性膀胱癌细胞系KK47,正常膀胱粘膜细胞系HCV29和高度侵袭/转移性细胞系YTS1由Dr.Hakomori(生物膜研究所/西北太平洋研究所 美国,华盛顿州,西雅图)友情提供;过渡癌细胞系T24和J82来自中国科学院(中国上海)的细胞库;细胞在含有10%胎牛血清(HyClone)和1times;青霉素/链霉素(Gibco; Carlsbad,CA,USA)的RPMI 1640或MEM培养基(HyClone; Logan,UT,USA)中培养,培养条件为37℃,5%CO2气氛。

通过同位素标记技术进行标记

将轻型精氨酸/赖氨酸(Arg0; Lys0)或重型精氨酸/赖氨酸(Arg6; Lys4)(Thermo Scientific; San Jose,CA,USA)配置成100mu;g/ mL。 为了防止精氨酸-脯氨酸转化,向培养基中加入200mu;g/ mL L-脯氨酸。 在处理之前,将细胞在SILAC培养基中生长5至6代。并且检查标记效率以确保所有标记的细胞系获得gt; 95%的掺入率。

总蛋白提取裂解

根据制造商的说明书用T-PER试剂(Thermo Scientific)对KK47和HCV29细胞系的总蛋白进行裂解和提取。简言之,用胰蛋白酶分离细胞(〜1times;10 7),用冰冷的1times;PBS(含有0.15M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液,pH 7.4)洗涤两次,用1mL含有蛋白酶抑制剂的T-PER试剂 (1mM PMSF和0.1%抑肽酶)进行裂解,在冰上温育30分钟,匀浆,并以12,000rpm离心15分钟。收集上清液并储存于-80℃环境中,BCA法测定蛋白浓度(中国,海门市,碧云天)。

凝集素微阵列分析

如前所述构建和分析凝集素微阵列[21,22]。简言之,在制造商推荐的缓冲液中,将来自Vector Laboratories(Burlingame,CA,USA),Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)或Merck(Darmstadt,Germany)的37种商业凝集素以高空间密度固定在环氧硅烷-涂层的固体支持物上。蛋白质样品用荧光染料Cy3(GE Healthcare; Buckinghamshire,UK)标记并应用于凝集素微阵列。温育后,用GenePix 4000B共焦扫描仪(Axon Instruments; Union City,CA,USA)扫描载玻片。

获取并分析微阵列数据

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使用GenePix Pro 3.0软件程序从扫描的图像提取数字资料。减去平均背景,从每个数据点除去小于平均背景plusmn;2倍标准差的值。在同一数据块内,每个凝集素三次重复的数据结果保留中值。每个凝集素的数据由归一化中值的平均值组成,所述归一化中值是一个数据块中的中值与数据点的中值之和的比值。从三个重复的载玻片一致地观察每个样品,并从九个重复的数据块中将每个凝集素的归一化中值和SD取平均值。A ijk定义为一个区块和一个实验中每个凝集素的三次重复的中值,其中i是凝集素的数目,j是一个实验中的区块数目,k是实验的编号。凝集素的标准化相对强度(NRI)通过下式计算:

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通过比较KK47和HCV29细胞系的归一化数据来评价蛋白质糖基化水平的相对变化。通过HCE软件程序(V3.0)进一步分析所产生的数据。 通过应用于每个凝集素信号的Student 的t检验法评估两组数据之间的差异。

凝集素染色

将细胞在具有无菌盖玻片的24孔板中培养以获得具有70-80%聚集的的单细胞层。先用冷的PBS洗涤细胞,再用2%新制多聚甲醛在室温下将其固定15分钟,然后在室温下用0.2%Triton X-100在1times;PBS中透化10分钟,最后在 PBS中用5%BSA封闭在4℃下过夜。将固定的细胞与在5%BSA中的15-20mu;g/ mL Cy3荧光素标记的凝集素(LCA,SJA和Con A)在黑暗中在室温下温育3小时。用PBS洗涤细胞,在室温下在1times;PBS中用20mu;g/ mL DAPI染色10分钟,再次用1times;PBS洗涤,并用荧光显微镜(Eclipse E600型; Nikon; Tokyo,Japan)成像。

凝集素印迹

通过蛋白质电泳以及凝集素印迹的方法分析从KK47和HCV29细胞系中分离的蛋白质。简言之,将样品煮沸并与5倍上样缓冲液混合,并置于10%聚丙烯酰胺分离凝胶上电泳。将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜(Immobilon-P; Millipore; Bedford,MA,USA)上。用1times;TTBS(150mM NaCl,10mM Tris-HCl,0.05%v / v Tween 20,pH7.5)将PVDF膜洗涤两次,并用封闭缓冲液(1times;TTBS,2%BSA)将膜在室温封闭1小时。然后将膜与如上所述的Cy3标记的凝集素(2mu;g/ mL,在封闭缓冲液中)在黑暗中在4℃下轻轻振荡,温育过夜。用TTBS洗涤膜两次,持续10分钟,并使用磷光计(Typhoon TRIO; Molecular Dynamics; Ramsey,MN,USA)通过红色荧光通道(532nm激发/ 580LP发射)用可选的电压对不同凝集素进行扫描。

组织微阵列分析

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包含17例膀胱癌和7例子宫颈癌的膀胱癌组织微阵列(TMA)(参见SI图S1和S1表中的详细信息)来自上海超生物科技有限公司。将涂石蜡的载玻片在63℃温育1小时,然后在二甲苯和梯度浓度酒精中脱石蜡。通过与封闭缓冲液(1times;PBS中的5%BSA)在4℃温育过夜来封闭非特异性蛋白质连接物。将用荧光染料Cy3标记的凝集素(2mu;g/ mL)涂布到载玻片上并在黑暗中温育3小时。然后将TMAs在1times;PBS中洗涤,室温下在1times;PBS中用20mu;g/ mL DAPI将其染色10分钟,再次用1times;PBS和1times;PBST洗涤。用共聚焦扫描仪扫描载玻片并用上述的荧光显微镜成像。

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唾液酸化的N-聚糖的酰胺化

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糖蛋白中唾液酸化的N-聚糖通过乙酰肼酰胺化,并在如前所述的尺寸排阻旋转超滤单元(Amicon Ultra-0.5 10 KD; Millipore)中释放[24,25]。简言之,将蛋白质(1.5mg)浓缩并加入8M尿素使之变性,还原,并通过加入10mM DTT和10mM IAM(Sigma-Aldrich)将其烷基化。用40mM NH4HCO3洗涤样品,并且用去离子水洗涤蛋白质以除去盐分。将脱盐的蛋白质再溶解于含100mu;L的1M乙酰肼,20mu;L的1M HCl和20mu;L的2M EDC的混合溶液中。将混合物在室温下孵育4小时。 将酰胺化的糖蛋白用40mM NH4HCO3洗涤,加入2mu;L在40mM NH4HCO3中的PNGase F(肽N-糖苷酶F),并在37℃温育过夜。通过离心收集释放的酰胺化的N-聚糖并冻干。

N-聚糖的洗涤

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如前所述使用琼脂糖凝胶 4B(Sigma Aldrich)将N-聚

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