银杏叶黄酮苷的提取及其抗菌作用的研究外文翻译资料

 2022-03-23 08:03

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银杏叶黄酮苷的提取及其抗菌作用的研究

Priyanka Sati，Praveen Dhyani，Indra Dutt Bhatt，Anita Pandey

生物技术应用，G.B. Pant国家喜马拉雅环境与可持续发展研究所，Kosi-Katarmal，Almora 263 643，北安恰尔邦，印度

文章历史：

2017年5月9日收到

2017年9月26日以修改后的格式收到

2017年10月2日接受

在线提供xxx

摘要

本研究旨在探讨提取方法对黄酮苷回收率的影响。文章中涉及到的银杏叶抗菌剂和抗氧化剂是从印度北安恰尔邦、印度喜马拉雅山的六个不同地点采集，采用了公认的四种提取方法，即浸渍，回流，摇床和索氏提取。其中回流得到的提取物有更高的抗菌抗氧化活性和更高的黄酮苷的含量。将银杏黄酮苷（槲皮素，山奈酚和异鼠李素）和粗提物进行抗微生物活性测试,革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌随纸盘扩散法而降低抑制浓度（MIC）。通过平板测量法中的银杏黄酮，观察到所有测试微生物都被显着抑制。黄酮苷的抗菌活性实验的相关系数表现出的结果证实了回流法作为一种潜在的萃取方法收益很高。此外，DPPH分析测得的抗氧化活性也发现更高。各地点之间黄酮苷的显着变化（p lt;0.05）也是如此并且发现从GB6位置收集的样品的槲皮素和异鼠李素是最高的，而GB5收集的样品的山奈酚是最高的。就总黄酮苷与抗菌剂的关系显着相关性（r lt;0.05，r lt;0.001）目前的研究，从而表明回流这一提取方法是最大量回收黄酮苷的最好的方法，并且具有银杏提取物更高的抗氧化和抗菌活性。

关键词：银杏叶 黄酮苷 抗菌剂 抗氧化剂 HPLC 印度喜马拉雅山脉

绪论

银杏树（常见名字有公孙树;家庭银杏树）是一种传统并且经济上有重要价值的植物，因为它的美学和药用价值，现在在中国，日本，韩国，法国，德国和印度的一些地区，尤其是在北阿坎德邦普遍存在。银杏的药用部分（新鲜或干燥的叶子和与肉质外层分开的种子）具有抗氧化，抗震动，伤口愈合，神经保护和抗菌特性以及在阿尔茨海默病患者中改善心理能力。银杏的药用和抗菌性能可归因于两种重要的化学成分，萜内酯（银杏内酯和白果内酯）和类黄酮糖苷。在其他成分中，类黄酮有着各种有用的性质，包括抗过敏，抗炎，抗氧化剂，抗微生物和雌激素活性，酶抑制和血管和细胞毒性抗肿瘤活性。

类黄酮可以在几种糖苷组合中以糖苷形式存在于植物中。 但是，提取物中糖苷配基与糖苷比例的增加表明其有所降解。 由于这个原因，可以用HPLC进一步研究的提取物中的糖苷配基可通过水解释放。银杏黄酮糖苷以槲皮素（Q），山奈酚（槲皮素） K）和异鼠李素（I）三种成分被报导。

提取具有抗菌活性的生物活性化合物可促进药理学研究，从而促进毒性更低更有效药物的合成.术语“抗微生物剂”是指抑制特定微生物群体的生长，例如抗菌，抗真菌，抗病毒药和抗原生动物药。与银杏叶提取物相关的大多数研究涉及植物成分的分离或药理活性的评估。但有关生物活性与分离化合物相关性的研究很少.尽管关于利用银杏作为有效抗氧化剂的研究正在进行中，但关于不同提取方法对黄酮苷复苏影响的文献其抗菌和抗氧化活性可以忽略不计。因此，本研究调查了不同提取方法对银杏抗菌，抗氧化和提取率的影响。所获得的结果将有助于确定黄酮类化合物含量，抗氧化剂和抗菌活性的变化以及选择合适的提取方法以利用制药物种的潜力。

材料和方法目的

植物材料

银杏叶在雨季从印度喜马拉雅山Uttarakhand的六个地点通过海拔梯度（1200-2002 m amsl）采集。 这些地点被称为GB1（Kalika，Almora），GB2（Chaubatia，Almora），GB3（Snowview，Nainital），GB4（Highcourt，Nainital），GB5（Glenthorn，Nainital）和GB6（GBPIHED，Almora）。 将叶样品在室温下干燥，并使用马达和研杵将其进一步粉碎成细粉，并在4℃下储存以用于气密拉链锁袋中的进一步分析。

化学制品

类黄酮（槲皮素，山奈酚，异鼠李素），对碘硝基四唑的标准参考化合物获自Sigma-Aldrich。 分析纯的乙醇（EtOH），正磷酸（H 3PO 4）和盐酸（HCl）和HPLC级甲醇是从Merck（Mumbai，India）获得的。 所有提取物和溶剂通过0.45mu;m膜滤器（Millipore）过滤。 生长培养基，胰蛋白胨酵母提取物（TY）和马铃薯葡萄糖（PD）购自Hi media，India。

提取程序

采用四种提取方法（浸渍，回流，振荡器和索氏提取）来获得它们各自的提取物。在回流法中，用3ml浓HCl和5ml水进行提取2.5小时。在60℃的索氏提取器中进行索氏提取6小时。在25℃以200rpm进行振荡器提取。然后将得到的液体提取物通过Whatman滤纸（第42号）过滤。萃取过程是以5g磨碎的叶样品与50mL EtOH（99.7％，v / v）相同的固体与溶剂的比例进行的。为了浸提提取，将提取物在室温下浸渍过夜。通过回流水解浸提，振荡器和索格利斯的上清液以检测HPLC中的黄酮苷。用Whatman滤纸过滤最终的水解滤液（第42号）。使用旋转蒸发器浓缩滤液以获得恒定质量的各自浸软的，回流的，索格利特和振动筛提取物。将浓缩的提取物溶于MeOH中，并在40℃超声处理15分钟。在HPLC分析之前，将制备的样品通过0.45mu;m过滤器过滤，并保存在4℃的气密容器中直至进一步分析。

HPLC分析

标准解决方案

储备溶液在甲醇中制备1mg / ml的槲皮素，山奈酚和异鼠李素，并且在定量范围内稀释以获得期望的工作浓度。 在峰面积与浓度的线性回归之后绘制校准图。 所有的参考标准溶液都储存在-20°C。

HPLC分析和色谱条件

HPLC分析采用色谱系统（Merck-Hitachi，Japan）进行，包括手动进样器，20mu;L进样量和UV-VIS检测器。 在环境温度下在C18柱上进行分离。 使用流动相（0.05％H 3 PO 4 / MeOH 50:50）11以及在32℃下0.8mL / min的流速使用等强度模式进行洗脱。 样品在360nm波长下运行40分钟。 类黄酮糖苷化合物的鉴定是根据相应外标的保留时间进行的。 内容的平均值用plusmn;标准误差计算。 结果表示为mg / 100g干重。

抗微生物和抗氧化活性的测定

测试微生物

测试微生物取自在该研究所的微生物实验室中建立的微生物培养物保藏中心。微生物培养物由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌和真菌代表。将细菌培养物保持在4℃的TY琼脂斜面上，并且还保存在-20℃的甘油储备液中，而将真菌培养物保持在4℃的PD琼脂斜面上。 （NRRL B-30408），玫瑰色微球菌（MTCC8133），恶臭假单胞菌（MTCC6842），粘质沙雷氏菌（MTCC4822），尖孢镰刀菌（ITCC4219）和山毛癣菌（Trametes hirsuta）等不同细菌和真菌分别进行提取物和标准黄酮苷的检测。 （MTCC11397）。测试微生物从已经在该研究所的微生物学实验室（GBPNIHESD）中建立的微生物培养物收集物获得。这些文化也已被国家/国际保存机构加入。其详细信息如下：美国伊利诺斯州农业部农业研究服务局（ARS）专利文化收藏的枯草芽孢杆菌（NRRL B-30408）;印度昌迪加尔微生物技术研究所微生物菌种培养物保藏中心和基因库和微生物技术，印度昌迪加尔的微球菌（MTCC8133），恶臭假单胞菌（MTCC6842），粘质沙雷氏菌（MTCC4822）和山毛癣菌（MTCC11397）印度新德里印度农业研究所的Type Culture Collection，印度。

圆盘扩散分析

琼脂扩散法进行抗菌活性测定。将测试生物即TY和真菌在锥形瓶中的PD肉汤中接种测试生物，并在25℃下孵育24小时。同时，制备TY和PD琼脂平板用于进行测定。为了测试针对测试微生物的抗微生物活性，将25mu;l微生物悬浮液接种在琼脂上，使用玻璃涂布器均匀铺展。将携带15mu;l叶提取物悬浮液的5mm滤纸圆盘（Whatman第42号）放置在接种单独微生物的琼脂表面上。将平板在25℃温育120小时;通过测量针对测试微生物的抑制区来记录观察结果。

最小抑制浓度（MIC）

银杏叶提取物的MIC根据临床和实验室标准研究所的方法确定[12,13]。在管中制备9至0.100mg / ml范围的稀释液，包括一种生长对照（培养基 测试生物体）和一种无菌控制（中等 测试提取物）。然后将接种在含有叶提取物的不同试管（9-0.100mg / ml）中并在25℃下温育，将微生物培养物的最终浓度调整至1.5x10 5 CFU / mL（600nm处的光密度0.1）。在添加（40mu;L）0.2mg / mL对碘硝基四唑氯化物并在25℃孵育1-4h后，记录MIC值，这取决于微生物。活性微生物将黄色染料还原成粉红色。 MIC定义为阻止这种变化并显示管中不存在生长的最低浓度。这通过在各自介质上铺板进一步证实。

DPPH自由基清除试验

用DPPH测定法评估叶提取物中的清除活性.14结果表示为mg抗坏血酸/ g干叶粉末。 制备浓度范围为9-0.100mg / ml的叶子提取物。 提取液的等分试样（1mL）与2mL甲醇合并，然后与0.25mL 1mM DPPH乙醇溶液合并。 将混合物涡旋（1分钟），然后在室温下静置（20分钟）。 在517nm处测量吸光度。 用甲醇代替DPPH和对照代替提取物样品制备参照样品。 每种样品和参比标准品的自由基清除活性按下式所得的抑制百分数确定：

％抑制= 100x（吸光度空白 - 吸光度样品）/吸光度空白

IC50值（mg / mL）是DPPH自由基清除50％时的抑制浓度，并通过线性回归分析插值获得。

图1.银杏黄酮苷（A）标准化合物（B-D），银杏叶浸渍，回流和索氏提取物的代表色谱图。

统计分析

所有实验一式三份进行。 计算每个样本的平均值和标准误差。 使用双向ANOVA（SPSS版本16）测试手段之间的差异分析。 确定显着性水平（p lt;0.05），并使用邓肯多重范围测试（DMRT）分离显着性差异。

结果

提取方法对黄酮苷回收率的影响

银杏叶提取物中的三种黄酮苷在提取方法上有所不同（图1）。 回流提取物显示槲皮素，山奈酚和异鼠李素的回收率最高（分别为117.791,136.915和107.265 mg / 100 g dw），而在浸提的提取物中记录到最低值（图2）。 六种提取方法中总黄酮苷含量（槲皮素 山奈酚 异鼠李素）差异显着（p lt;0.05）。 所有提取方法中总黄酮苷含量的回收率均为回流gt;浸渍gt;索氏（表1）。 然而，在轨道振荡器方法的情况下，银杏黄酮糖苷的浓度是不可检测的。

表1.不同提取方法和位置的总黄酮苷的浓度变化。

数值是平均值plusmn;标准误差; GB1，Kalika; GB2，Chaubatia; GB3，Snowview; GB4，高场;GB5;格愣索恩; GB6，GBPIHED，Kosi; 基于DMRT，列中相同后面的平均值没有显着差异（p lt;0.05）。

关于提取方法，不同类黄酮苷的数量也有显着差异（p lt;0.05）（图3A-C）。浸提液中槲皮素和山奈酚的含量（图3A）在GB5中较高（38.70和68.47 mg / 100 g dw），而异鼠李糖在GB6中较高（46.68 mg / 100 g dw），最低含量估计在GB1位置槲皮素（9.75mg / 100g干重），山奈酚（6.10mg / 100g干重）和异鼠李素（11.98mg / 100g干重））。在回流提取物的情况下（图3B），GB6中槲皮素（181.89 mg / 100 g dw）和异鼠李素（167.03 mg / 100 g dw）较高，GB5（194.46 mg / 100 g dw）位置中山奈酚含量较高。在GB3中估计槲皮素（72.16 mg / 100 g dw）和异鼠李素（50.00 mg / 100 g dw）的最小含量，而在GB2位置中最低含量为山奈酚（69.43 mg / 100 g dw）。在索氏提取的情况下（图3C），GB6中槲皮素含量（15.55 mg / 100 g dw）较高，GB2位置中含量最低（2.96 mg / 100 g dw）。 GB4（61.89 mg / 100 g dw）和GB1（63.32 mg / 100 g dw）位置的山奈酚和GB4中的异鼠李素（38.58 mg / 100 g dw）较高。在GB2（6.74 mg / 100 g dw）的位置，GB1（22.12 mg / 100 g dw）和GB2（22.56 mg / 100 g dw）和异鼠李素含量估计为最低的山奈酚含量。

图2.使用不同提取方法获得的类黄酮糖苷（槲皮素Kaempferol和异鼠李素）。

图3.不同位置的银杏黄酮糖苷（a）浸渍（b）回流和（c）索氏提取，数值为平均值plusmn;标准误差; 基于DMRT，列中相同后面的平均值没有显着差异（p lt;0.05）。

提取方法对银杏黄酮类

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