创新化学合成和构象提示脂肽利拉鲁肽外文翻译资料

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创新化学合成和构象提示脂肽利拉鲁肽

利拉鲁肽是用于治疗II型糖尿病的新一代脂肽药物。在这项工作中,我们描述新的通过化学方法充分制备其方法。这些策略的关键步骤是解决方案的综合Lys/gamma;-Glu构建块，Fmoc-Lys-（Pal-gamma;-Glu-OtBu）-OH，其中Lys和Glu残基通过其侧链连接，gamma;-Glu是Nalpha;-棕榈酰化。然后将该二肽衍生物插入到固相上的肽序列中。当利拉鲁肽是获得的产品纯度高，产量高，我们的方法对于工业生产来说可能特别有吸引力。我们也报告这里是模拟环境中的圆二色性构象分析的结果，提供了新的见解利拉鲁肽的作用机制。版权所有copy;2016

关键词：圆二色性;构象分析;脂肽;利拉鲁肽;肽合成

介绍

全球血糖平衡引起的疾病增加障碍，如糖尿病，发展至关重要的新药以及其在工业上的生产规模。在不同类型的糖尿病中，II型包括大多数病例[1]。伴随着许多功能障碍作为胰岛素抵抗和肾脏再吸附的破坏，它是复杂的心血管疾病的风险。最近几年，已经开发了几种药剂治疗这种类型的糖尿病，如二甲双胍，alpha;-葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷二酮[2]。最近，一类新药被引入肠溶蛋白基治疗的临床实践[3,4]。多肽类的利拉鲁肽属于这一类。它是一种衍生物胰高血糖素样肽-1（GLP-1），天然存在的肽激素具有最有效的促胰岛素活性之一。GLP-1是生产和加工的较长肽的一部分GLP-1在胰腺和肠内[5]。

利拉鲁肽（图1，图A），其序列为第一报道在专利WO9808871（Novo Nordisk）中GLP-1的段7-37，但不同于原来的肽附着Nalpha;-棕榈酰-gamma;-Glu部分链和用Arg替代Lys34[6-9]。

利拉鲁肽的氨基酸序列显示97％的同一性天然的激素虽然存在棕榈酰部分将在其体内行为中起关键作用。有趣的是，利拉鲁肽具有相同的生理活性（GLP-1受体）激动剂）作为亲本肽[10]。它刺激胰岛素以葡萄糖依赖的方式分泌，抑制胰高血糖素活性，并降低所有类型的血糖水平。它改善了也是beta;细胞的活性，并防止其退化[11]。此外，它引起体重减轻，脂质水平降低等作为甘油三酯和胆固醇，并具有心脏保护作用[12]。

已知与肽结合的脂质部分保护后者从酶降解[13-15]。观察到这种阻力利拉鲁肽，因此使其适合用作可注射剂药物。增加白蛋白亲和力和聚集体形成，通过脂质共轭促进，同样负责利拉鲁肽在血液中的长半衰期及其延迟吸收这允许每日一次的管理[9,16-18]。。详细的研究了一系列GLP-1类似物，包括利拉鲁肽，就是显示脂质部分和接头结构都影响白蛋白约束[19]。结果，肽被保护二肽基肽酶IV和中性的代谢降解内肽酶[20]。值得注意的是，利拉鲁肽半衰期增加皮下注射后11-15 h，而GLP-1只持续一次生理条件下几分钟。有趣的是，最近推出的GLP-1模拟半凝质显示均匀更长的半衰期和减少的身体清除[19]。这种改进的行为归因于有利的白蛋白结合由脂肪酸链介导。

图1.（A）利拉鲁肽的氨基酸序列。与...的变化对胰高血糖素样肽-1（7-37）的显示为绿色;

（B）A通过化学修饰制备利拉鲁肽的方案重组肽前体（OSu，1-氧代琥珀亚氨基）。

生物活性机制似乎也是一个重要的问题。通过分析超离心技术，观察到利拉鲁肽即使以0.001mM浓度聚集[21,22]。pH范围为0.001-1.2mM（10mM Tris/高氯酸盐）缓冲液），并且在100mM NaCl中显然形成七聚体结构。最近还发现，利拉鲁肽低聚物受pH影响[23]。在同一研究中，据报道，在磷酸钠缓冲胶束样中最初形成8个分子的簇，然后重组当pH降低时，进入12个利拉鲁肽分子的组装体低于6.9。这种转化具有缓慢的动力学，因为它需要几个天到系统达到平衡。而且，是的表明这种重新配置伴随着失去的alpha;螺旋结构，但3D结构变化相反pH变为更高的值。因此，附加信息是需要解开聚集体的形状和它们的pH依赖。

以前列出的利拉鲁肽优良的生物学特性，强调了该肽作为药物的重要性。出于这样的原因，在工业规模上合成的几种方法被描述文献（表1）。

报告的第一个策略包括使用重组体肽前体，其进一步化学修饰用gamma;-（Pal-Glu-OtBu）酰化Lys20的侧链，最后去保护和纯化（表1，WO2004/029077）（图1，面板B）。

还值得一提的是产生融合肽，通过重组DNA获得，含有亲和标签，a可切割标签和所需的肽[24]。这个方法允许用于通过亲和力容易地纯化产物色谱法。在最后一步中，化学剂代替了可裂解标签以释放靶肽。

化学合成通常预计的准备肽骨架通过常规固相策略使用Lys残基上的正交保护基。然后选择性去除侧链保护基，合成继续坚持支持或解决方案实现目标分支结构。值得指出的是分支利拉鲁肽的结构及其低溶解度显着妨碍其合成和纯化。

为了确定利拉鲁肽的化学合成更容易的方法，适应工业应用，我们调查了几个不同的方法，并引入了一种新颖的策略。综合这里报道的是在硕士论文的框架中设计的在帕多瓦大学的工业化学，并发表2014年12月[25]。2015年12月，当我们进行圆形二色性（CD）分析并对这份手稿进行处理时，Adlai Nortye Pharmaceutical的中国肽组公司专利严格相关合成方法（表1，WO2015/100876）。

我们在这项贡献中报告的这一新战略的关键步骤，是Lys20（GLP-1中的Lys26）的溶液中的制备棕榈酰化二肽及其随后掺入肽链直接在树脂上产生分枝结构体。这种方法可以显着降低成本因为它限制了昂贵的Lys衍生物的使用。另外还不完整通常与最终步骤相关联的联轴器被避免，从而显着降低了合成时间和数量副产品。我们认为对于工业生产来说我们化学方法的利拉鲁肽在经济上将会更多与生物技术方法相比具有吸引力。

除了新的化学合成，我们在这里报告在磷脂存在下利拉鲁肽的CD分析结果双层。我们相信这个环境比较接近生理条件与缓冲水相比系统，可能有助于更好地描述机制的利拉鲁肽的作用。实际上，肽的两亲性质以及各种膜的生物液体中的存在类型，包括血细胞和血管的类型不可避免的是利拉鲁肽与磷脂的相互作用。此事件可能会改变肽的构象偏好因此，其生物活性。

材料和方法

材料

鸢尾生物技术：N，N-二甲酰基甲酰胺（DMF），二氯甲烷（DCM）（肽级），N-甲基-2-吡咯烷酮，N，N-二异丙基乙胺（DIPEA），三氟乙酸（TFA），哌啶，N，N#39;-二异丙基碳二亚胺（DIC），1-[双（二甲基氨基）亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧六氟磷酸盐，H-Glu-OtBu（OtBu，叔丁氧基）。Sigma Aldrich：用于质谱的乙腈（MeCN）（gt;99.9％），质谱用TFA（gt;99.9％），乙酸乙酯，甲基叔丁基醚（MTBE），丙酮，三异丙基硅烷（TIS），2,2,2-三氟乙醇（TFE），N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu），1-羟基-1,2,3-苯并三唑（HOBt），2,4,6-三甲基吡啶（可力丁），十二烷基硫酸钠（SDS），2-油酰-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，石油醚（40-60），无水MgSO 4，NaCl。卡博辛：N，N，N#39;，N#39;-四甲基-O-（1H-苯并三唑-1-基）脲六氟磷酸盐（HBTU）。CBL生物制药：2-氯吗啉氯化物树脂。成都百世兴科技工业株式会社：Fmoc-Ala-OH（Fmoc，芴基-9-甲氧基羰基），Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Arg（Pbf）-OH（Pbf，2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基），Fmoc-Gln（Trt）-OH（Trt，三苯甲基），Fmoc-Glu（OtBu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His（Trt）-OH，Boc-His（Trt）-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys（Boc）-OH（Boc，叔丁氧基羰基），Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Thr（tBu）-OH，Fmoc-Trp（NinBoc）-OH，Fmoc-Val-OH。

表1利拉鲁肽制备专利

色谱

超高效液相色谱（UPLC）分析在Agilent Technologies 1290系列仪器上进行使用Agilent Zorbax Ecplipse Plus C8色谱柱（4.6times;50 mm，1.8mu;m）和洗脱剂A：TFA/H2O 0.1％v/v，B：TFA/MeCN 0.07％v/v;在224nm检测。进行制备纯化Agilent Technologies 1260 Infinity色谱仪使用Agilent Eclipse XDB-C8 21.2times;250 mm色谱柱相同洗脱液。

质谱分析

在Mariner API-ToF工作站上获取质谱（PerSeptive Biosystems，Framingham，MA）和Agilent 6530质量精度Q-TOF，工作在正模式。

核磁共振光谱法

1在Bruker AC光谱仪上记录1 H NMR光谱（200MHz）在氘代氯仿（99.96％d;Sigma Aldrich）

圆二色光谱

使用JASCO J-715获得圆二色性光谱分光光度计使用Hellma在r.t.记录所有光谱石英细胞与Suprasilreg;窗口，光程长度0.02cm，带宽2nm，扫描时间常数2mu;s速度为50nm/min。信噪比得到改善累积四次扫描。这些值用...表示[theta;]R，总摩尔椭圆率[deg cm2 dmol？1]除以氨基酸残基数。分光TFE和含水1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和SDS用作溶剂。

Fmoc-Lys（Pal-gamma;-Glu-OtBu）-OH的合成

Pal-Glu-OtBu

1. 将HOSu（2.7g，23.4mmol）在30ml MeCN中的溶液加入到Pal-OH（6g，23.4mmol）在90ml DCM中的溶液中，然后加入DIC（3.62ml，23.4mmol）。反应混合物为搅拌38小时，再加入0.3当量的HOSu和DIC添加。滤出沉淀物;反应混合物为浓缩直到沉淀物形成并保持过夜在4℃。滤出产物，浓缩至50ml，并通过加入使所得物质结晶100ml石油醚。
2. 向Pal-OSu（4.65g，13.2毫摩尔），在步骤（1）中制备

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