谷氨酸单塔肽连接脱硫外文翻译资料

 2022-03-24 10:03

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谷氨酸单塔肽连接脱硫

Katie M. Cergol, Robert E. Thompson, Lara R. Malins, Peter Turner, and Richard J. Payne*

悉尼大学化学学院，新西兰2006年，澳大利亚

摘要：描述了一种有效的谷氨酸连接方法。一个gamma;-硫醇-Glu结构单元仅通过3个步骤就能连接到被保护的谷氨酸上并且接入肽的N-末端。一系列肽硫酯证明了这些肽在脱硫肽连接上的化学应用，合成骨质疏松药—特立帕肽突出表现了这种方法的效果。

自然的化学连接被广泛的应用于构建肽和蛋白质的较小的肽片段。这种通过促成获得各种各样蛋白质的方法极大的拓宽了我们对蛋白质结构和功能的理解,包括那些难以表述的修饰蛋白质。就机制上而言，反应的第一步涉及到半胱氨酸（Cys）之间的可逆反式硫酯化反应。

一个肽片段的N-末端的残基与另一个肽反应的C-末端的硫酯部分组合。通过五元环过渡态快速的进行S到N酰基的转移，然后促进天然肽键的高产率和与之形成完全的化学选择性。这种反应除了有快速和高强度的性质外，该方案的又一个优点是在水介质中，并且在中性pH的条件下与无侧链保护氨基酸连接。

肽和Cys残基的丰度低蛋白质促使后连接脱硫化学的发展，由此用于促进连接的Cys残基可以被脱硫以提供丙氨酸（Ala）残基，或者通过氢化基本介导的途径，例如，通过使用流行的水溶性自由基引发剂2,2#39;-偶氮双[2-（2-咪唑啉-2-基）吡啶-3-基）丙烷]二盐酸盐（VA-044）。扩大连接化学的范围，广泛的研究工作最近集中在合成beta;-，gamma;-和delta;-硫醇衍生的氨基酸以及硫醇衍生的芳族氨基酸（方案1），可以通过与天然化学连接相似的机制在连接脱硫化学中实施。

在这里，我们通过一个短而可扩展的途径报告了合适保护的gamma;-硫醇-GM构建块的第一次合成，以及其在肽连接 - 脱硫化学中的应用。尽管在S至N酰基转移期间该反应将通过六元环进行，由于硫醇的gamma;位（方案1B），我们设想连接反应仍然是基于先前在同型半胱氨酸和其他gamma;-硫醇氨基酸的连接研究而简单的。此外，我们报告了在Glu处进行混合连接脱硫的条件，从而可以在粗蛋白反应中进行脱硫，无需中间纯化。

最初提出的gamma;-硫醇-GM构建块1的合成从Boc Glu（OtBu）-OAll（2）开始，开始于在gamma;-位上安装2,4-二甲氧基苄基（DMB）保护的硫醇（方案2）。这是通过2次去质子化后的巯基化试剂3来促进的（参见有关合成细节的支持信息）。令人满意的是，以良好的产率（83％，方案2）和作为单一非对映异构体（gt; 99％dr）分离得到的DMB-保护的gamma;-硫醇-Glu 4。最后，将4进行Pd催化的烯丙酯脱保护条件，得到高产率的所需的gamma;-硫醇-GM构建块1。最近研究表明beta;-硫醇-asp的两种非对映异构体促进了可比较的结合，我们决定仅关注用于连接研究的分离的非对映异构体。

使用适当保护的gamma;-硫醇-Glu 1制备，随后在标准Fmoc策略固相肽合成（SPPS）下，将该构建嵌段并入模型肽5的N末端，从Rink酰胺树脂开始，得到树脂结合肽6（方案3）。不幸的是，在伴随的树脂切割和脱保护后(90:5:5 v/v/v TFA/iPr3SiH/H2O), 分离五肽7和硫内酯8，而不是在N-末端显示gamma;-硫醇Glu的所需肽。在这种情况下，酸性切割条件促进了N末端的肽剪接，这是由于酸不稳定的DMB保护基团脱保护后所显示的亲核硫醇部分的攻击，通过有利的五元环过渡态在酰胺主链上发生。

为了避免这种不必要的途径，我们决定交换酸不稳定的DMB-硫醇保护基团，用于酸稳定但是还原性不稳定的甲基二硫化物保护基团（方案2）。通过使DMB-保护的gamma;-硫醇-Glu 1向四氟硼酸二甲酯（甲硫基）锍（9）进行转化，使得该保护基交换以中等收率（55％，方案2）。令人满意的是，使用（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷基六氟磷酸盐（PyBOP）和N-甲基吗啉（PyBOP）将该修饰的gamma;-硫醇-GM构建块10掺入与树脂结合的肽11中（NMM）在酸脱保护后，从树脂中切割肽和HPLC纯化（68％，方案3），得到所需的模型肽12，没有任何痕量的不需要的肽拼接产物。

在这一阶段，通过使用三（2-羧乙基） - 膦（TCEP），然后是PyBOP（10）的还原性硫羟化反应合成的环状衍生物13的单晶X射线分析证实了亚磺酰化反应的立体化学结果 和N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）（方案2）。 硫代内酯13的立体化学证实为（2S，4S），表明在亚硫酰化作用后得到4的（2S，4S）非对映异构体。随着所需的模型肽12在手，我们接下来将我们的注意力转移到使用多种C-末端模型肽硫酯探查连接 - 脱硫化学中肽12中的N-末端gamma;-硫醇-Glu部分在实验中的应用这些反应的范围（条目1-5，表1）（见合成细节的支持信息）。

在37℃和pH 7.2-7.4的连接缓冲液（6MGn·HCl，100mM Na 2 HPO 4，50mM TCEP，5mM相对于12）中进行连接反应，加入苯硫酚作为芳基硫醇催化剂。 令人愉快的是，每个连接反应在16小时内完成，反相HPLC纯化后的产率优异（68-83％，表1）。 应注意，含有连接产物的HPLC部分立即冻干，以避免由酸性HPLC洗脱液引起的酸介导的肽剪接。

接下来，我们使用VA-044作为自由基引发剂，在TCEP和还原性谷胱甘肽存在下，使纯化的连接产物进行自由基脱硫.15在所有情况下，脱硫反应在65℃16小时内完成，得到天然肽 产物在反相HPLC纯化后产率优异（表1，84-98％产率）。

在以前的Cys和beta;-硫醇-asp的单罐连接脱硫化学报告的基础上,我们接下来有兴趣开发这个概念来实现含有gamma;-硫醇-GG的模型肽的一锅转化（表1，条目1-5）。我们设想，这不仅可以通过预防额外的纯化步骤来简化方法学，而且可以避免在纯化期间由gamma;-硫醇促进的肽剪接。具体来说，每个连接反应首先进行仔细监测，并显示通过LC-MS分析确定的4小时内完成，除了与模型硫酯Ac-LYRANV-S（CH2）2CO2Et（ 条目5），其需要16小时的反应时间才能完成。此后，通过用乙醚洗涤从反应混合物中提取苯硫酚，以防止苯硫酚对脱硫反应的中毒。立即用TCEP（500mM），还原型谷胱甘肽（40mM）和VA-044（200mM）处理连接反应混合物，在两个步骤中提供所需的肽产物（表1中56-74％ 产量）。应该注意的是，如我们最近在beta;-硫醇-asp中所述的那样，在没有VA-044的情况下，也尝试在存在Cys残基的情况下进行选择性脱硫的单釜反应。不幸的是，由于在选择性脱硫方案（方案3）所需的酸性pH下发生的肽剪接，导致产物的复杂混合物，因此我们不能实现类似的选择性脱硫反应。

对于带有C-末端Ala，Met，Phe和Val残基的肽硫酯进行一锅连接脱硫反应，也观察到肽副产物14，这可能是由所得VA-044自由基与随后形成的肽基团反应而产生的 H-硫醇的H取代（图1）。由于在两步连接脱硫过程中没有观察到这种副产物，尽管萃取方案，仍然存在痕量的芳基硫醇。然而，在所有情况下，这种副反应没有显著影响分离的产率或反应方法的总体效率（图1）。

已经证明了gamma;-硫醇-Gu的连接脱硫反应的范围和效率，包括一锅方案，我们接下来将注意力集中在将方法学应用于肽药物特立帕肽（15）的合成（Forteo，Eli礼来公司）。用于治疗糖皮质激素诱导的骨质疏松症，这种重组的34个氨基酸甲状旁腺激素是市场上唯一刺激骨骼生长的骨质疏松症药物。我们设想，可以通过两个片段之间的连接反应容易地获得该肽，即肽硫酯16，对应于特立帕肽（1-18）并带有C末端Met残基，肽17具有N-末端gamma;-硫醇 - Glu残基，代替特立帕肽（19-38）（方案4）。为此，首先使用标准的Fmoc-SPPS程序在三苯甲基氯树脂上合成对应于特立帕肽（20-34）的肽18（参见有关合成细节的支持信息）。gamma;-硫醇-GM构建块10的偶联和酸性裂解和脱保护然后在反相HPLC纯化（基于原始树脂负载）（方案4）之后，得到所需的肽片段17，产率为18％。肽17与Met-硫酯16的连接（参见合成细节的辅助信息）在前述的连接条件下在16小时内完成。HPLC纯化后，以优异的产率（82％）分离所需的连接产物19。纯化后，在上述自由基条件下的脱硫还顺利进行，得到天然的特立帕肽（15），产率优异（95％）。最后，我们还通过采用我们的一锅式连接脱硫策略合成了特立帕肽（15），令人满意地提供了所需的肽产品（71％，方案4）。

总之，我们已经开发出一种简便且可伸缩的新型gamma;-硫醇-GM构建块10的合成，其可以容易地并入多种肽中以促进连接化学。所得的gamma;-硫醇-GG肽与一系列硫酯进行容易的连接反应，并且可以使用基于自由基的条件将天然肽产物脱硫。此外，我们已经扩展了这种方法，包括一锅式连接脱硫级联，证明是高效和高产的，同时减少了对连接产物的中间纯化的需要。此外，该方法已成功应用于FDA批准的骨质疏松药物特立帕肽（15）的高产量制备中，这表明该方法将来将在肽和蛋白质的合成中具有广泛的应用。我们实验室的进一步研究将重点扩大该方法，以纳入蛋白质靶标的合成。

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支持信息

详细的实验程序，分析HPLC痕迹和表征数据。 此材料可通过互联网http://pubs.acs.org免费获得。

作者信息

通讯作者

*电子邮件：richard.payne@sydney.edu.au.

笔录

作者声称没有竞争的经济利益

致谢

我们承认ARC Future研究金计划（FT130100150）用于研究经费和APA（RET）和IPRS（LRM）计划的博士研究经费。 我们还要感谢詹姆斯·蒙哥马利先生（悉尼大学）对这项工作的早期贡献。

参考文献

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