靛玉红负载的SLN纳米粒的制备与研究及其对人胶质瘤U87MG细胞的抗癌作用外文翻译资料

 2021-12-19 09:12

英语原文共 10 页

靛玉红负载的SLN纳米粒的制备与研究及其对人胶质瘤U87MG细胞的抗癌作用

贝鲁兹·约翰里，赛义德·贾法里·诺杜尚，阿里·拉什蒂尔，埃勒姆·里斯马尼夫，帕文·马哈达维亚尼，佐赫勒·萨尔塔纳特布尔，萨贾德·拉希米尼亚德斯，莫兹甘·莱加尼斯和马苏德·科斯拉瓦尼·奥

摘要

靛玉红是一种中药成分，被认为是一种抗癌药物。然而，由于其疏水性，临床疗效受到限制。纳米技术为癌症患者的治疗打开了新的窗口。多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最严重、最常见的原发性肿瘤。胶质母细胞瘤靶向治疗的常见问题之一是肿瘤组织中药物的有效性。本研究在GBM细胞株(U87MG)上制备了负载靛玉红的固体脂质纳米粒，并对其治疗潜力和抗肿瘤作用进行了评价。以棕榈酸十六烷基酯和聚山梨酯80为原料，采用高压均质(HPH)热模法制备了单链淀粉。然后，表征了sln的大小、zeta电位、药物包封率(EE %)和载药量等性能。用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察了单核细胞的形态和尺寸。采用不同的散射量热法(DSC)测定了该配方的结晶性。在正常脑pH值为7.2和瘤变pH值为6.8时，评价药物释放量和抗肿瘤效果。SLNs的平均尺寸为130 nm, zeta电位为16 mV, EE为99.73%。差示扫描量热法(DSC)测定结果表明，药物包埋在单核细胞内是正确的。

两种pH值的药物释放评估均表现出持续释放特性。MTT试验结果表明，在多种形式的GB上，靛玉红负载单核细胞的抗肿瘤活性较药物和空白单核细胞显著增加。本研究表明，负载靛玉红的单核细胞肺癌具有良好的抗癌作用。

介绍

靛玉红是中国传统药物的一种成分，被认为是一种有效的抗衰老、抗炎和抗血管生成化合物.靛玉红的抗肿瘤作用可抑制糖原合酶激酶3 (GSK-3)、Cydin依赖激酶(CDKs)、c-Src和成纤维细胞生长因子受体。然而，靛玉红水溶性差，限制了其作为一种有前途的抗肿瘤药物的临床应用(Chen et al . 2012)。除了试图通过合成新的衍生物来提高靛玉红的溶解度外，药物在肿瘤细胞中的生物利用度和控制释放仍然具有挑战性(Chen et al .， 2012)。在提出的几种促进药物生物利用度的策略中，基于纳米技术的药物传递系统已经彻底改变了肿瘤靶向治疗。纳米颗粒(NPs)具有体积小、快速、简单和低成本等吸引人的特性，在药物溶解度和控制癌症药物释放方面是有效的(Singh和Lillard, 2009)。固体脂质纳米颗粒(SLN)是20世纪90年代初以来潜在的胶体载体之一(Schwarz et al.， 1994)。它们具有良好的生物相容性、药物释放更大的灵活性和低毒性(Cavalli et al, 2002)，近年来，许多亲脂性药物如安定、环孢霉素、紫杉醇等已被报道SLNs较好地递送(Kim et al, 2015)。

癌症被认为是一种遗传病，治疗上有很多困难。癌症治疗的部分挑战是由于肿瘤异质性、药物传递障碍和对传统治疗的获得性耐药(Hajighasemlou et al.， 2015;Saltanatpour等，2016,Zugazagoitia等，2016;

Johari等，2017;Johari和Zargan, 2017)。多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见的原发性脑肿瘤类型(Rock et al, 2012)。尽管在临床试验中出现了新的化疗药物，但它们治疗GBM的成功受到了限制。治疗胶质母细胞瘤的常见问题之一是药物渗透性和肿瘤细胞耐药性(Lawson等，2007)。因此，需要一种药物传递系统来改善抗癌药物向大脑的传递，同时将药物的副作用降到最低。使用NPs给药可以提高药物对细胞的生物利用度(Saraiva et al, 2016)，此外，由于肿瘤厌氧糖酵解升高，肿瘤内的微环境相对于正常组织(pH为6.4 vs . 7.4)呈现酸性区域。已经有人尝试利用pH靶向纳米技术来克服药物浓缩的局限性。

最近的研究表明GSK-3是胶质瘤重要的治疗靶点。靶向GSK-3抑制胶质瘤细胞的增殖是治疗GBM的一种很有前途的方法。

本研究制备了负载靛玉红的单核细胞生长调节剂，并对其包封率、载药量、释放靛玉红的能力、稳定性和对人胶质瘤U87MG细胞的细胞毒性进行了表征。该方法的目的是通过纳米技术提高靛玉红的疗效并减少其临床局限性。

材料：靛玉红(98%)由宝鸡国康生物科技有限公司提供。十六烷基棕榈酸盐是从细胞生物学国际联合会。

含靛玉红单核细胞素的抗癌作用

Panreac Quimica(西班牙)和polysorbate来自默克公司(德国达姆施塔特)。磷酸缓冲盐a 3-(4,5 -二甲基噻唑-2-酰基)- 2,5 -二苯基四唑溴化铵(MT)购自美国米苏市Sigma-Aldrich公司。U87MG细胞从巴斯德研究所(伊朗德黑兰)获得，在杜尔贝克改良的Eay培养基(DMEM)中培养(Biosera，法国)。青霉素、链霉素、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶均来自Gib Invitrogen (NY, USA)。所有其他化学物质都来自Mer(德国达姆施塔特)，去离子水遍及美国各地。

SLN的准备

采用热高压均质化(HPH)方法制备SLN (Mehnert and Mader, 2001)。在fi阶段，棕榈酸十六烷基酯的2g在75℃熔融。接下来,t融化脂质相分散在热surfacta水溶液(在同一温度)高速搅拌15分钟20000 rpm (UItra-Turrax, IKA T25,德国获得pre-emulsion随后homogeniz在80 c,使用高压均质器(IK LABORPILOT 2000酒吧,德国),执行5 homo enization周期。系统在49℃冷却5分钟后，转移至室温，得到颗粒。药物载体分散体除在50℃熔解时在脂相中加入1 mg靛玉红外，均以同样的方法制备。

颗粒大小，多分散性指数，zeta电位分析

采用动态光散射技术测定了制备的SLNs的粒径、zeta势和多分散性ind (PDI)。

SLN形态特征

利用扫描电镜(XL30, Philips，荷兰)对制备的SLNs wer进行了形态学表征。滴一滴冻干SLNs于玻片上，室温风干。干燥后的试样在15kv氩气气氛下喷涂金，扫描电镜观察TEM测量用透射电镜观察单核细胞的形态;这些样品用蒸馏水稀释，然后放在一个涂有碳的铜网格上。磷钨酸在碳膜上添加%)以增加对比度，取样进行透射电镜观察。样品在室温下干燥。

差示扫描量热法

采用差示扫描比重计(Mettler-Toledo DSC 823 GmbH，瑞士)进行平衡计分卡分析，以评估SLNs的热行为(Attama等，

2008)。准确称量药物原料(靛玉红，25.1 mg)，在3个铝锅中分别加热药物/脂质混合物(5.3 mg)和装载有靛玉红的SLN纳米颗粒(10 mg)，温度范围为0-500C，干燥氮气吹洗(20 mL/min)下加热速度为10 C/min。一个空的平底锅被用来确定基线。

封装效率和载药量测量

采用紫外-可见分光光度计OPTIZEN 2120UV plus (Mecasys, Ko rea)对靛玉红在SLNs中的包封率(EE%)和载药量进行了测定。简单地说，使用Amicon UItra-15离心式过滤装置，切断30kda (Millipore, USA)，将SLNs从溶液中分离出来，用离心分离机对游离靛玉红进行过滤。上清的浓度测定是基于之前建立的二甲基亚砜(DMSO)中靛玉红的校准曲线，使用5个浓度范围为1-30 g/mL。这是重复三次,平均使用而错误计算标准偏差(土SD)。药物包封率和载药量分别由式I和式2计算单核细胞内药物的重量

药物释放研究

体外药物释放采用透析ba法(Subedi et al. 2009)。采用21 (w/v)碳酸氢钠和0.05% (w/v) EDTA对西格马实验室12 kDa分子切断透析管进行预处理5 min，去除蒸馏水中的紫外吸收化合物和重金属离子洗涤，蒸馏水fo 1煮沸

制备好的透析管4C置于含0.1% (w/v)叠氮化钠的buffe中保存5 min。将sln -靛玉红悬浮液(5 mL)置于透析管中，浸泡于含29聚山梨酸盐80的200 mL磷酸盐缓冲盐水(pH 6.4和7.4)中，置于磁性搅拌器热板上

搅拌速度为每分钟100转，温度为379C。在0.5、1、2、4、6、8、24、48、72 h的时间间隔内，收集释放介质样品(5mil)进行浓度分析，用相同体积的新鲜释放介质替代。采用紫外-可见分光光度法，在标度曲线的基础上测定了药物的释放浓度。

细胞培养

在添加10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，以5%CO2、37C培养人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞U87MG。

体外细胞活力和细胞毒性

采用MTT法测定U87MG细胞的活力，评价负载靛玉红单核细胞的细胞毒性(Zitron et al.， 2013)。Briely在100 L细胞培养液中96孔板上每孔接种1万个细胞，培养24h。

用五种不同浓度的SLN纳米颗粒处理细胞，靛玉红和靛玉红负载的SLN(2.5、12.5、25、375和50ppm)， pH分别为6.8和7.2。检测浓度受低载药量和低井容的影响。但是，这些结果是根据药物的剂量和药物负载的单链神经网络来解释的。在379C孵育48小时后，100 ul。每孔加入5 mg/ mL MT溶液，379C孵育2 h，取出培养基，每孔加入200 L DMSO，搅拌均匀，溶解福尔马赞晶体。采用microplate reader (BioTek ELx808, USA)以630 nm为参考波长，在570 nm处读取样品的光密度。

稳定性研究

SLNs制剂在49℃保存45天。并与新鲜配方进行了粒度、多分散性指数和zeta势储存的比较

制备体系的稳定性。

统计分析

实验一式三份。Quantitati数据以均数plusmn;标准差(SD)表示

采用学生t检验单因素方差分析检验统计学意义，P-val lt; 0.05为显著性(GraphPad Prism 5.04, La Jolla, CA 92037, US/)

结果

采用高压均质法制备了预乳状液，并在高于脂质熔点的温度下制备了单链淀粉。为了获得合适的最终产品质量，t预乳液经过5次高压均质器，在4℃快速冷却后转移到roo温度。

粒子表征

将样品用蒸馏水稀释1-20，置于超声波下15分钟，用超声波仪器完全分离纳米颗粒，使其在乳液中分散良好。粒径为z平均粒径，SLN粒径为104 nm, zeta势为15.7 mV，靛玉红粒径为118nm, zeta势为16.3 mV。统计学分析SLN与SLN-靛玉红差异不显著(Pgt;0.05, 95% CI)。SL和sln -靛玉红的PDI值均在0.3以下，表明hig颗粒均匀。值得注意的是，在SLN中印迪鲁姆包封降低了PDIs。粒子siz PDI和zeta势如表1所示。图中为SLN和靛玉红负载SLN的典型粒径分布和zln。

SLNs的表面形貌

图2A为加载SLN后的形态学o和靛玉红透射电镜图像。磷钨酸aci (PTA)是一种pH值在5.0 ~ 8.0之间呈阴性染色的popula染色剂，用于避免冻干。SLN和靛玉红加载后的SEN图像显示了纳米级的球形颗粒。根据图像中的500个nn条，SLN和Indirubin加载SLN wer约100 nm。

差示扫描量热法

研究了靛玉红、十六烷基棕榈酸酯、物理混合物和负载靛玉红纳米粒的DSC热行为。使用DSC分析。十六烷基棕榈酸酯作为SL.N制剂的固体脂质组分，其热谱图显示其在539C左右出现了吸热峰。在370℃时测定了靛玉红的熔点。同时，负载靛玉红的SLN剖面在50℃左右出现单峰。图3为纯药物、脂质药物和单链药物的DSC热图

采用紫外-可见分光光度计(UV-vis)对不同浓度的靛玉红溶液在290hm下的吸光度进行测定，设计了靛玉红溶液在DMSO中的标准曲线。

浓度为1-30 g/mL时，吸光度呈线性变化。用标准曲线法测定了上清液中游离靛玉红的浓度。然后计算了SLN纳米粒包封靛玉红的包封效率。以SLNs中所含药物与游离药物总量的重量比作为包封效果的指标。SLNs制备过程中使用的药物总量为1 mg。因此，SLNs的包封率为99.73%。测定荷重比(0.94 mg)与荷重比(2000 mg)，计算荷重(DL%)。综述了sln -靛玉红的包封率(EE%)和载药量(DL%)。

体外释放研究

将纳米颗粒制剂置于PBS介质中浸泡的透析袋中，在不同pH值下(6.4和7.4靛玉红为亲脂分子，饱和溶解度较低，因此我们在PBS中加入2% w/v吐温80作为溶解介质。测定72 h内SLN体外释放行为，并以累积释放百分率表示(图4)。根据靛玉红标准曲线计算吸光度wa值或浓度。结果表明，pH值为6.4的培养基中药物的释放速度低于7.4，而最高的释放时间为48 h后。药物在SLN表面附近的初始释放速度较快，包膜药物的释放速度较慢。

pH值分别为6.8和7.2时，48h后的浓度。空白SLN的细胞毒性作用在两种pH值下均无显著差异，空白SLN制剂的IC50值为

pH为72时

资料编号：[4451]

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