盐胁迫下两个紫花苜蓿品种的脯氨酸含量、活性及抗氧化酶活性的变化外文翻译资料

 2022-08-15 03:08

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盐胁迫下两个紫花苜蓿品种的脯氨酸含量、活性及抗氧化酶活性的变化

摘要:

不同耐盐性的两个苜蓿（Medicago sativa L.）品种的植株经过三次盐处理，分别是用70, 140和210 mM NaCl处理7天。盐胁迫对植株的根、茎、叶均有抑制作用，且在140和210 mM NaCl处理条件下，Zhongmu 1品种的根、茎、叶品种的干重显著高于Defi品种。Defi品种的丙二醛(MDA)含量的积累显著大于Zhongmu 1品种，表明在140和210 mM NaCl处理条件下脂质过氧化程度高。本文对两个苜蓿品种叶片超氧化物歧化酶（SOD、EC 1.151.L）、过氧化氢酶（CAT、EC 1.111.6）、过氧化物酶（POD、EC 1.111.7）、抗坏血酸过氧化物酶（APOX、EC 1.111.11）、游离脯氨酸积累和脂质过氧化率等活性和活性异构体的变化也进行测量研究。在盐胁迫后，抗氧化酶活性及其亚型发生了变化，且品种Defi和品种Zhongmu1的变化程度不同，在210 mM NaCl处理条件下脯氨酸含量在Defi品种中的积累明显著大于Zhongmu1。这表明脯氨酸的积累可能是盐耐受的结果而非原因。

关键词：抗氧化酶、脯氨酸、Medicago sativa L.脂质过氧化、盐胁迫

引言:

盐是限制植物生长，产量和分布的主要环境因素，土壤水分含量高正下量大，管理不当是土壤盐渍化的主要原因，因此了解盐胁迫的生理生化机制是培育耐性品种，改善环境条件，提高作物产量的关键。

盐胁迫可能导致活性氧（ROS）产生，比如超氧阴离子（O2·-），过氧化氢（H₂O₂），氢根离子（·OH）和单氧（1O2）。这些细胞毒性物质ROS，在细胞分解代谢时由线粒体和叶绿体产生，可以通过损伤，蛋白质、膜、脂类和核酸的细胞组分来破坏正常的代谢。

为了减少氧化损伤植物，植物采用酶和非酶的机制来清除活性氧。据报道，植物抗氧化能力与植物耐盐性之间存在着相关性。超氧化物歧化酶（SOD）可以将（O2·-）转化成H₂O₂。大量过氧化物酶如抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）催化H₂O₂的分解。虽然过氧化氢酶不存在于叶绿体中，但与其他还原酶一起HaliWaveasad途径可以解毒H₂O₂。APX通常表现在高水平的叶绿体中，在抗坏血酸谷胱甘肽循环中起着关键作用。POD广泛分布在细胞的各个植物组织中，可以催化以消耗过氧化氢的细胞内各种底物的氧化。

脯氨酸通常被认为是一种与细胞渗透调节有关的可溶性物质，当植物处于干旱和盐胁迫条件下其积累作用增加。然而，Lutts等人对水稻脯氨酸积累的研究表明，在细胞渗透调节中，脯氨酸积累有一定的贡献，在植物中还可能存在其他功能。也有报道称，脯氨酸积累与植物耐盐性呈负相关，因此脯氨酸积累仍然是与盐胁迫相关，不论是植物在盐胁迫下产生的结果或是作为抗盐胁迫反应机制的基础。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化的产物，在植物体承受盐胁迫下产生大量积累。细胞膜稳定性已经被广泛用于区分一些作物的抗逆性和易感品种，在某种情况下，更低的MDA含量可能和胁迫耐受性相关。

作为甜土植物，紫花苜蓿在盐胁迫下会表现出明显的生物量锐减，在不同品种间出现的响应程度不同。Zhongmu1品种主要分布在我国黄海流域地区，那里被发现存在盐碱地，而中国境内普遍种植的是Defi品种。据推测，较高的抗氧化酶活性和脯氨酸含量有助于保护紫花苜蓿植株免受盐胁迫的影响。因此，本研究旨在探究盐胁迫对植物生长、脂质过氧化、脯氨酸积累、总叶绿素含量、主要抗氧化酶活性及亚型的影响。以两种苜蓿品种为材料，研究两个苜蓿品种叶片对盐胁迫的调整机制。

材料与方法:

植物材料与生长条件:

用6%次氯酸钠溶液对紫花苜蓿（Medicago saliva L.）、Zhongmu1和Defi两个品种的种子进行表面灭菌处理5分钟，然后在25/20℃下潮湿的沙土培养基上萌发8或16小时，然后每个品种以每处理组 4个相似植株为单位进行固定，安置在有孔的方形泡沫并移植到塑料容器（12厘米高，28厘米宽，43厘米长）包裹铝箔，以最大限度地抑制辐射引起的根系温度升高，并最大程度地抑制藻类的生长和繁殖，并进一步促进根的生长。每个容器含有4.4 L标准营养液组成：2.5 mM Ca(NO3)2, 2.5 mM KC1, 1 mM MgSO4, 0.5 mM (NH4)H2PO4, 2*10-4mM CuSO4, [1*10-3mM ZnSO4 0.1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-FeNa, 2*10-2 mM H3BO3, 5*10-6mM (NH)4MO27O4, 1 *10-3 mM MnSO4。实验在植物生长实验室中进行，相对湿度达到45%，温度为30°C日/ 25°C夜间，光周期为13小时，光合光子通量密度为450mu;mol m-2S -1。植株在标准营养液中生长15 天，然后在70 mmolL-1培养基中每12小时加入NaCl，使盐度暴露于植物中，直至达到70, 140, 210 mmolL-1的最终浓度。营养液每七天更换一次，每日添加去离子水，以代替蒸腾损失的水分。使用空气泵连续地对营养溶液进行充气。

20天后，将各处理的6个植株移去，分为根、芽和叶进行生长和生化参数测定。在60℃烘箱干燥48 小时后得到干重。

脯氨酸含量和丙二醛的测定

用Tijen和Ismail（2005）的方法通过硫代巴比妥酸反应测定丙二醛含量。脯氨酸含量根据Tijen和Ismail法（2005）测定。将0.5g 叶片在3%（W/V） 磺基环己烷中匀浆，加入酸酸和冰醋酸后， 在98℃下加热30分钟，在室温（25℃）下停止反应。以甲苯为萃取剂，在520 nm处以甲苯为溶剂，从液相中提取甲苯的馏分。脯氨酸浓度用校准曲线测定，并表示为毫摩尔脯氨酸g·-1）FW。

酶提取与分析:

对于蛋白质和酶提取，用50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）将0.3克叶片样品混匀，其中含有1 mM EDTA-Na和2%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。在4℃条件下进行完全提取，在4℃下，在10000times;g转速离心15分钟， 收集上清液，进行酶活力测定。以牛血清白蛋白为标准，用Bradford （1976）法测定酶提取液中的蛋白质浓度。

过氧化氢酶（CAT，EC 1.111.6）活性通过测量240 nm处H₂O₂的消失速率进行测定。反应的最终体积混合物中含有50 mM磷酸钠缓冲液（ pH 7 ）和2% H₂O₂，通过加入100mu;l叶粗提取物对该溶液进行反应。酶活性以每毫克蛋白质为单位（每分钟消耗的毫摩尔过氧化氢）。

过氧化物酶（ POD ， EC 1.111.17）活性测量方法由Tatiana（1999）稍加修改而确定。反应混合物含有0.05 M磷酸钠缓冲液（pH 5.5）、2%过氧化氢，0.05 M愈创木酚和0.5ml 酶提取液，最终体积为5ml。反应起始于酶提取物的加入，四氢叶酸的形成在470nm处测量。一个单位酶被定义为在25℃每分钟降解1毫摩尔过氧化氢的酶量。

抗坏血酸过氧化物酶（ APX， EC 1.111.11 ）活性根据Nakano和Asad（1981）的方法测定。反应混合物含有50mM 磷酸钾（pH 7），0.2mM 乙二胺四乙酸，0.5 mM抗坏血酸，2% 过氧化氢和0.1毫升酶提取物，最终体积为3毫升。记录在290nm 处的吸光度在1分钟内的减少， 并用消光系数计算出抗坏血酸盐的量。一个单位的APX定义为每1 mmol-ml·1抗坏血酸在25℃条件下每分钟氧化的量。

超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.151.1）活性分光光度法测定硝基蓝四氢呋喃（ NBT ）在560 nm处（Beauchamp和FrimoViic 1971）光化学还原的抑制作用。反应混合物（3 mL）由50mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.8）,13 mL蛋氨酸、75mu;m NBT、10 mu;M EDTA-Na2、2mu;m核黄素和0.3mL 酶提取液组成。装有反应混合物的测试试管将在35℃下在4000lx 下保持10分钟， 一个单位SOD活性被定义为在560 nm处抑制50% NBT还原反应所需的酶量。

过氧化氢酶（ CAT ）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和超氧化物歧化酶（SOD）的等电聚焦电泳和活性染色

国产聚丙烯酰胺凝胶在赵（2005）所描述的聚酯薄膜上形成凝胶。吸附条带（0.5毫米）被用作沿覆盖玻璃板的长边的间隔件。阴极和阳极电极分别放置在凝胶的上下两侧，阳极溶液含有0.332%（W/V）天冬氨酸，和0.368% （ W/V ） 谷氨酸， 阴极溶液含有0.472%（W/V）精氨酸、0.364%（W/V）赖氨酸和12%（W/V）乙二胺。应用条带定位离阳极1.5厘米。电源被设置在2500 V并随时调整， 以使一旦开始电泳，输出电压大约维持为200 V。

过氧化氢酶（CAT）

凝胶的聚合溶液含有4.24克尿素、0.1克可溶性淀粉、20.8毫升丙烯酰胺（T＝6.8%、C＝2.5%）、1.2 mL pH 2-9两性电解质（SeraAlt、德国）、26.4mu;l N、N、N′、N′-四亚甲基二胺和108mu;l 20%（W/V）过氧化二硫铵。在聚焦后，在ASISH染色过程中，对凝胶进行过氧化氢酶活性的染色。 凝胶在室温下用18 mmol L-1硫代硫酸钠和679 mmol L-1H2O2溶液进行30 秒的培养。用90mmol L-1 0.5%冰醋酸酸化的SiOH碘化物溶液冲洗和淹没凝胶。CAT酶的阴性带出现在凝胶的蓝色背景上。

过氧化物酶 (POD)

凝胶的聚合溶液含有4.24克尿素，20.8毫升丙烯酰胺（ T＝6.8%，C＝2.5%），1.2毫升pH 2-9两性电解质（Seravalt，德国），26.4mu;l N，N′，N′- 四 亚 甲 基 二 胺 ，108 mu;l 20%（W/V）过硫酸二铵。根据ASISH染色程序。凝胶在室温下（在黑暗中）用50 mL 50 mmol L-1乙酸钠缓冲液（pH 5）、330mu;L愈创木酚进行染色，加入330mu;L 的30% H2O2 ，直到凝胶上出现红棕色条带。

超氧化物歧化酶（SOD）

凝胶的聚合溶液含有4.24克尿素，20.8毫升丙烯酰胺（T＝6.8%，C＝2.5%），1.2毫升pH 2-9两性电解质（SeraAlt，德国），26.426.4mu;l N，N′，N′- 四 亚 甲 基 二 胺 ，108 mu;l 20%（W/V）过硫酸二铵。根据ASISH等染色步骤。 在加入有染色缓冲液50 mmol L-1磷酸钾缓冲液、pH 7.8、0.1 mmol L-1 EDTA、28mmol L-1四甲基乙二胺（TEMED）的凝胶中孵育后，在0.003 mmol L-1 核黄素，0.25 mmol L-1 NBT与室温下黑暗条件中放置30分钟，凝胶在两个荧光管（15 W） 下暴露，直到SOD活性带变得可见。染色后立即扫描凝胶。使用BIO RAD拍摄。使用高、低和宽PI校准试剂盒测定pH梯度曲线。根据相对迁移距离评价酶异构体的PI。

统计分析：

每一处理条件后的数据均为平均值plusmn;标准偏差（n＝6）。ANOVA 分析处理前后显著性差异。在P＜0.05概率水平上计算LSD值。

结 果

生物量：

根、茎和叶的生长（图I）在两个品种中都受到盐处理的抑制，虽然Zhongmu 1比Defi耐盐性更强。在210 mm NaCl处理下，Zhongmu 1株的根、茎、叶干重分别为对照组的68%, 36%和对照组的53%，而Defi值分别为对照组的29%, 12%和26%。两个品种的单株干重受盐的影响最大。在140和210 mM盐分处理中，Zhongmu1的根、茎、叶干重显著高于Defi品种。

脯氨酸积累：

盐胁迫处理导致苜蓿品种脯氨酸含量显著增加（表1）。然而，Defi品种中的脯氨酸积累比Zhongmu 1大得多，在140和210 mM盐处理下分别为（605.9和1086%）和（323.2和652.5%）。在盐浓度为140～210 mM的Zhongmu 1品种的叶中，脯氨酸含量没有显

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