聚糖的毛细管电泳分离外文翻译资料

 2022-08-10 04:08

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聚糖的毛细管电泳分离

摘要：自2014年以来，毛细管电泳已经成为了一种有力的碳水化合物分析方法。该方法具有高分辨率，能按照电荷大小比分离碳水化合物。原理应用主要集中在与生物疗法和生物标记研究高度相关的N-聚糖上。用于N-聚糖结构鉴定的技术进展包括迁移时间索引，糖苷外切酶和聚集素分析以及质谱分析。已经开发出的毛细管电泳方法能分离具有相同单糖序列但位置异构体不同的聚糖，且能确定组成聚糖的单糖是alpha;还是beta;连接的。本文重点讨论毛细管电泳在生物标记物发现与生物疗法中N-聚糖分析的重要作用。其中包括对糖胺聚糖以及食品和植物产品相关的单糖，二糖和寡糖的碳水化合物分析的简短讨论。重点介绍该领域的创新技术与未来。根据2014年至今毛细管电泳对糖科学的重大贡献来预测技术的发展方向。

1.介绍

碳水化合物是信号、结构和能量的基础。这些分子在可再生能源、疾病、衰老、食物和治疗中发挥着重要作用。聚糖在信号传递中的关键特性支持其在疾病诊断、预后和治疗干预中的应用。糖科学包括多种应用，如绘制蛋白质靶标中的糖肽定位图，或阐明糖基化在蛋白质合成、信号传导和配体受体结合的作用。在医学研究和生物制药中，深入了解导致糖基化变化的过程变得越来越重要。制药业中糖基化调节生物活性并强烈影响抗体受体功能。这有可能大大提高药物性能，但需要包括毛细管电泳(CE)在内的有利技术支持，在整个制造过程中监测微观异质性。

仅在2016年和2017年发表的综述中，最近的高活跃度就证明了对用于糖科学应用中CE的兴趣。本综述的重点是分析释放的寡糖，以突出CE方法学中动态和快速发展的进展。定向与方法学。2015年，几个工业和学术实验室参加了一次实验室间测试。该方法包括对蛋白质测试样品进行N-聚糖定位，并且在面积和迁移时间上显示出良好的可重复性。目前，商业套件通过简化样品制备以提高产量，使该技术在工业中的使用更加常规化。这些进展是偶然的，因为抗体药品市场预计将以健康的速度增长。据估计，到2020年，该市场全球年贸易额将达到1250亿美元。这就产生了对高通量分析的更为迫切的需求，而这一需求可以由CE来满足。

CE有几个优点。在没有焦耳加热的情况下，高电场可缩短分离时间并提高效率。进样量在飞升到纳升范围内。在24小时内只需要几毫升的运行缓冲液。在商业仪器上进行的分离是自动化的。激光诱导荧光的检测限在飞摩尔范围内。典型的仪器只有一根毛细管，毛细管和溶液都有温度控制。多根毛细管可用于一台仪器中，以提高通量。例如，用于DNA测序的仪器可以容纳16到96个毛细血管。甚至可以多次进样，以便在单次运行中传递样品，从而消除驻留时间。仪器和方法学应用方面的创新在继续，可以观察到，这是使这一技术更容易获得的一种推动力。通过计算器将CE与质谱仪连接起来，以及数据库和软件，提高了数据分析的简便性。分析技术不断地适应碳水化合物分析中不断增长的挑战，而CE在糖科学研究中发挥着独特的作用。

这篇综述是对最近CE糖科学应用活动的详尽更新，涵盖了从2014年到2017年的进展。认识到该领域是多学科的，因此关注聚糖结构的基本原理以及毛细管电泳分离。提出了标记和高度自动化、高通量样品制备方法的发展。主要考虑了三种识别聚糖峰的主要方法，包括迁移时间指标法、酶或凝集素谱分析和质谱（MS）。讨论了在标记方面的进展，特别是在创建高度自动化的高通量样品制备方法方面的进展。重点放在前沿应用和技术上。综述了生物标记物的发现、治疗学的表征以及在食品和病原体分析中的应用。该报告最后总结了一些新兴的CE技术领域，这些技术将在未来的糖科学领域中产生长期和持续的影响。

2.背景

2.1碳水化合物基础

通过考虑碳水化合物结构的复杂性，更容易理解与碳水化合物分析相关的分析挑战。本综述简要描述了对CE重要的因素。其他来源可能提供关于聚糖命名和结构的详细描述的额外信息，以及在Ms中观察到的不同命名和裂解模式的概述。

单糖是多糖（如聚糖和糖型）的结构单元，可以粗略地认为它含有一个经验式（Cx（H2O）n）。存在大量不同的单糖，但是为了便于本综述，图1中只给出了6种结构图1如右.六种具有代表性的D构象单糖结构。葡萄糖、甘露糖和半乳糖是常见的未取代己糖。岩藻糖少一个羟基，称为脱氧己糖。N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸代表取代的己糖。

证明这些结构的细微差别。羟基取代基的位置是己糖（甘露糖、葡萄糖和半乳糖）之间唯一的差别。取代己糖包括N-乙酰神经氨酸和N-乙酰氨基葡萄糖。岩藻糖是脱氧己糖的一个例子。

这些糖单体的聚合大大增加了结构的多样性，以及碳水化合物的复杂性。寡糖和多糖的结构可以随单体结构不同连接方向而改变。可以是alpha;或beta;，连接的位置可以是不同的，如图2所示的三糖。尽管已知的几类寡糖的生物合成途径限制了生理相关结构的多样性，但仍存在一系列不同的碳水化合物结构，这就是为什么这些分子在信号传递中发挥了重要作用的原因。这种多样性的结果是，同分异构结构不仅是可能的，而且是高度可能的。在这种复杂的碳水化合物结构中，其他重复的结构基元也被发现。这包括由重复的二糖单元（糖胺聚糖）组成的线性多糖。

上图为仅通过唾液酸和半乳糖单糖之间的连接而形成的唾液酸乳糖的两种结构。图A为6′-唾液酰乳糖，由alpha;2minus;6连接而成，图B为3′-唾液酰乳糖，由alpha;2minus;3连接而成。

这类多糖在生命活动中起着多种作用，包括运动功能、细胞生长和抗凝血作用，由许多熟悉的分子类别组成，如肝素/硫酸乙酰肝素、软骨素/硫酸皮肤素、透明质酸和硫酸角蛋白。

在生物标记物研究和生物治疗中占主导地位的一类碳水化合物是天冬酰胺连接的碳水化合物或N-聚糖。丝氨酸和苏氨酸聚糖（O-聚糖）也存在，但是，由于与聚糖标记蛋白相关的差异，它们的电泳分析没有达到与N-聚糖相同的加速程度。通过beta;-消除化学释放聚糖后的还原胺化反应。N-连接的聚糖的共同特征是由N-乙酰葡糖胺残基和甘露糖残基组合而成的核心结构，如图3。

复合N-聚糖因岩藻糖、半乳糖额外的分支和对分N-乙酰基氨基葡萄糖、唾液酸及其其他修饰（如聚乳糖胺）的存在而有所不同。尽管N-聚糖仅代表一类碳水化合物，但在CE中却十分关注这些结构，因为它们是翻译后的修饰，对生理功能有重大影响，这使得N-聚糖对于生物标记物发现和生物治疗中的实际应用具有强大的作用。尽管N-聚糖结构有复杂性和多样性，但N-聚糖标记仍能得到简化。通过靶向多糖结构的还原端可使标准的还原胺化将分子标记为单个荧光团，在N-聚糖结构上添加带电标签与CE兼容。

2.2毛细管电泳基本原理

毛细管区带电泳是一种基于电场输运的分离方法，非常适合于生物分子的分离。电渗流（EOF）和电泳迁移率是CE的两种基本传输机制。EOF是背景电解质的总体趋势。在裸露的熔融石英毛细管中，由于毛细管表面的负电荷和存在的电场，EOF从阳极向阴极移动。电泳迁移率是电荷大小比的函数。分析物被吸引到阳极或阴极，分子的大小决定了传输的速度。这两种运输方式在大多数CE分离中是重叠的。在Ce分离中，在裸露的熔融石英毛细管中的注入位置处为阳极，当EOF存在时，分析物的迁移顺序是小的正电荷分子、大的正电荷分子、混合中性分子，大的带负电荷的分子、和小的带负电荷的分子。

用毛细管电泳分离碳水化合物是独特的，因为大多数糖是不带电荷的，除了含有酸性糖（如N-乙酰神经氨酸、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸）的聚糖。此外，碳水化合物分子缺乏生色团，在紫外范围内不能用吸光度检测法检测。这些混淆的因素是可以通过用荧光团标记碳水化合物来解决。事实上，大多数被标记的碳水化合物是带电的，这在CE中是一个优势，因为它确保了被标记的碳水化合物在电场中迁移。荧光标记物8-氨基芘-1，3，6-三磺酸盐（APTS）是最早报道的用于CE分析寡糖的染料之一，在氩离子激光的488nm谱线附近有最大激发。如图4所示，使用APT进行标记已经很成熟了。通过还原性胺化反应对寡糖进行的共价修饰，以接近100%的标记效率产生单标记产物。

图4.

还原胺化的简化机理，因为它是用还原剂（钠）用APT标记碳水化合物（氰基硼氢化物）。

一旦标记的聚糖带上了负电荷，将分离调整为依靠电泳运输来加强电荷-尺寸比的差异。如图5所示，

中性聚糖在与APT共轭后带有三个额外的负电荷。用APT标记的唾液酸化的聚糖甚至更阴性，因此有更快的迁移。通过表面改性消除毛细管壁上的表面电荷，从而抑制EOF。在反极性下施加电场，以将阴离子驱动至检测窗口。用最简单的分子量和分子大小，电泳迁移率mu;是分子大小的函数，式mu;=q/6pi;eta;r.其中q是电荷，eta;是背景黏度电解质，r是分子的流体动力学半径。黏度在摩擦阻力中起作用。并且是实现区分低聚糖异构体所需的高分辨率的一种策略。添加剂通常包含在背景电解质中以提高分辨率。使用线性凝胶促进的碳水化合物分离机理仅基于电荷-尺寸比，而不是基于尺寸的筛分。这是观察较大的生物分子，如蛋白质和DNA。当其应用于碳水化合物分析时，当凝胶包含在背景电泳中时，分离技术可互换地称为CE或毛细管凝胶电泳。荧光团辅助的碳水化合物电泳也已被使用，虽然这种命名可能会产生误导，因为该方法可以使用平板凝胶以及CE。

2.3毛细管电泳相对于其他方法的性能

各种分析工具在糖科学中得到了广泛的应用，包括色谱法、质谱、离子迁移率、和凝集素阵列，CE已发展成为补充现有技术的一种强有力的方法。2014年，霍夫曼等人报道了相对于反相色谱结合荧光检测基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与液相色谱-电喷雾电离-MS相比，使用CE的综合评估。通过测量1201名个体血浆样品中IgG分子的N-聚糖，对这些技术中的每一种进行了评估。基于分离的N-聚糖分析方法的比较使用显著较大的样本集来评估更大范围的糖基化存在对IgG抗体也有报道。这项研究目的是建立这些技术的优点，因为专注于特定技术会影响大规模研究的结果以及资源投资。作者发现了几个CE的重要优点。首先CE的高分辨率可实现异构体分离和连锁分析。其次仅使用CE和液相色谱法结合荧光检测才能实现定量。第三，通过使用具有16个毛细管阵列的仪器，相对于两种液相色谱方法均获得了非凡的通量。作者报道的CE仪器成本与液相色谱法和低端MS方法相当。作者指出，CE方法可大大降低每个样品的成本。作者确定的局限性包括糖科学界接受程度不高和缺乏大型结构数据库。其他报告将CE的性能与用于分析N-聚糖的分离技术进行比较。相对于疏水相互作用液相色谱分离和使用2种不同标记物的荧光，我们比较了毛细管凝胶电泳和荧光检测的性能，证明了这些方法之间的良好一致性以及CE分离位置异构体的优势。一项补充研究比较了CE和荧光检测之间的差异，作为参考。对CE的不同模式进行了评估，包括毛细管区带电泳（在存在EOF的情况下分离），毛细管凝胶电泳（在极性反转且EOF和凝胶添加剂被抑制的情况下分离）和DNA荧光团辅助CE（使用遗传分析仪在高温下毛细管电泳）。作者指出在准确性、精确度和分离性能方面只有很小的差异。亚当奇克等人探讨了基于毛细管电泳、反相液相色谱通过比较来自不同健康哺乳动物的治疗性IgGFC-糖基化产物的结果，他们的工作结果表明，CE和HILIC具有相似的性能，并且都比反相液相色谱更适合分解复杂的混合物。在另一份报告中，Mahan等人，将毛细管凝胶电泳与HILIC比较，证明虽然两种方法产生的结果具有可比性，电泳成本更低，消耗的样品更少，操作的通量更高。该方法适用于物种内多克隆抗体Fab片段糖基化差异的鉴定，并且糖基化产物在人、恒河猴和小鼠中显著不同。

3.碳水化合物衍生化

3.1标记研究进展

用APTS标记聚糖仍然是CE分离的选择方法。通过还原胺化用APTS标记聚糖是公认的和优选的方法。最近报道的还原性胺化化学的改进是使用催化剂促进氢的直接转移。催化剂的使用对于自动化并行处理和随后的高通量非常重要，因为它避免了在酸的存在下使用氰基硼氢化钠生成氰化氢。

除了APTS，其他标记试剂也可用于碳水化合物的CE分离。最近，2-氨基苯甲酸被用于氦镉激光器而不是氩离子激光器。以及用于紫外-可见吸收检测或CE与MS耦合。还报道了7-氨基-4-甲基香豆素的紫外发光二极管激发荧光标记物。这种染料在接合和标记后是中性的，所以使用硼酸，它与二醇络合形成负络合物以分离聚糖。

尽管聚糖分析扩展到使用其他染料，由于几个实际原因，APTS仍然是CE分析聚糖最常用的染料。APTS标记的聚糖的荧光强度是未结合的APTS的40倍。此外，由于APTS的激发波长在可见光范围内（lambda;ex=488nm），因此可以减少生物物质的背景干扰。而其他染料在紫外区受激发，2-氨基苯甲酸（lambda;ex=325nm）和7-氨基-4-甲基香豆素（lambda;ex=354nm）。

3.2改进样品处理的分析技术

鉴于抗体疗法的重要性以及对高通量规模评估糖基化的明确需求，研究实验室中用于糖基化，标记和纯化样品的酶促和化学步骤是常规在药物加工中实施CE分离的瓶颈。为了使获得标记的聚糖产品所需的这些样品处理步骤自动化，已经投入了大量精力。使用Protein A提取盒从粗裂解物中纯化抗体治疗剂和标记，可以通过组合商品或完整的试剂盒实现。其他提高通量的方法包括在加工过程中固定酶或聚糖的不同策略。在分析之前，N-连接的聚糖通常从糖蛋白中酶促释放，虽然化学释放的方法最近被描述为基于使用次氯酸钠的简单氧化释放。常用于N-聚糖释放的酶可使用商业上可获得的谷胱甘肽树脂和谷胱甘肽S-转移酶PNGaseF的融合蛋白固定。作者证明了固定化酶更快的反应动力学以及固定化和自由溶液PNGaseF的转化率都很高。这些自动化步骤已与Biomek FXP实验室自动化工作站完全集成。

可以使用不同的商业试剂套件，通过改进的工作流程来制备聚糖。自动化处理除了使用HILIC提取盒来纯化标记的聚糖外，标记技术还在继续发展。磁珠（AB Sciex公司的Agencourt CleanSeq Magnetic Beads）已被用于自动化标记的5个连续步骤。制造的商业珠粒含有羧酸官能团。在去糖基化过程中，糖苷是以带正电荷的糖胺形式释放出来。这种糖蛋白产物离子与羧酸珠配对，很容易从废酶反应中

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